于 平，劉 航，朱鵬志，胡淳玉，楊柳貞，賀 敏，馬 健

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州 310018）

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸[1]，最初是在馬鈴薯塊莖組織中發(fā)現(xiàn)的[2]。在微生物中，γ-氨基丁酸參與了芽胞桿菌的孢子萌發(fā)過程[3-5]。大腸桿菌、乳酸菌、單增李斯特菌和分枝桿菌等部分細(xì)菌還可利用γ-氨基丁酸來抵抗酸性環(huán)境[6-8]。

目前，γ-氨基丁酸作為一種生物活性因子廣泛應(yīng)用于食品和制藥工業(yè)中。它可以作為一種功能因子添加到食品中，如奶酪、茶和面包的制作過程中經(jīng)常添加γ-氨基丁酸[9-11]。在制藥工業(yè)中，γ-氨基丁酸作為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可改善大腦內(nèi)血漿和生長激素的濃度以及蛋白質(zhì)的合成[12]。口服γ-氨基丁酸還能顯著降低血壓和治療神系統(tǒng)經(jīng)障礙[13]。Hagiwara 等[14]的報道稱γ-氨基丁酸作為胰島素的強(qiáng)分泌劑，可有效預(yù)防糖尿病。γ-氨基丁酸的攝入也可以調(diào)節(jié)疼痛和焦慮以及血清和脂質(zhì)水平[15-16]，抑制癌細(xì)胞增殖[17]，提高記憶力和學(xué)習(xí)能力[16]。

由于γ-氨基丁酸的諸多有益功能和日益增長的商業(yè)需求，越來越多的學(xué)者嘗試通過化學(xué)或生物法制備γ-氨基丁酸[17-19]。由于生物法具有反應(yīng)過程簡單、催化效率高、反應(yīng)條件溫和和環(huán)境相容性好等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為制備γ-氨基丁酸的主要方法[20]。γ-氨基丁酸可由谷氨酸脫羧酶（GAD）催化谷氨酸脫羧制備（圖1）[1，21]，因此研制高校廉價的谷氨酸脫羧酶是生物法制備γ-氨基丁酸的關(guān)鍵。

圖1 L-谷氨酸脫羧制備γ-氨基丁酸Fig.1 Preparation of γ-aminobutyric acid by L-glutamate decarboxylation

谷氨酸脫羧酶能催化谷氨酸和谷氨酸鹽的α-脫羧反應(yīng)合成γ-氨基丁酸[1]。它是一種磷酸吡哆醛依賴型酶，包括谷氨酸脫羧酶A（GadA）和B（GadB）2 個亞基[3]。據(jù)報道，谷氨酸脫羧酶廣泛存在于哺乳動物的大腦、植物和微生物中[22]。來源不同的谷氨酸脫羧酶，在酶學(xué)性質(zhì)上存在一定的差異。目前許多學(xué)者已經(jīng)從植物[23]、大腸桿菌[24]、曲霉[25]和乳酸菌[26]中成功分離了谷氨酸脫羧酶，并對其性質(zhì)進(jìn)行了研究。例如，Ueno 等[27]從短乳桿菌中分離純化了谷氨酸脫羧酶，并測定其生化特性。Park 等[28]報道從新分離的短乳桿菌中克隆了編碼谷氨酸脫羧酶的基因。Nomura 等[29]對谷氨酸脫羧酶進(jìn)行了分離鑒定，并克隆了乳酸乳桿菌中含有的一個編碼谷氨酸脫羧酶的基因。Kim 等[30]對來源于短乳桿菌BH2 的谷氨酸脫羧酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)該酶的一些抑制劑。另外，人們從玉米胚[31]、豆豉[32]和發(fā)芽粟谷[33]等植物中分離出谷氨酸脫羧酶，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。遺憾的是，天然來源的谷氨酸脫羧酶催化效率低，穩(wěn)定性差，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。

鑒于此，本研究首先從大腸桿菌中克隆編碼谷氨酸脫羧酶A 的基因gadA，并構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-gadA，然后將該載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），成功篩選能高效表達(dá)谷氨酸脫羧酶A 的重組大腸桿菌菌株大腸桿菌BL21/pET28agadA。將該菌株誘導(dǎo)表達(dá)后，采用Ni2+親和層析分離純化谷氨酸脫羧酶A，進(jìn)一步研究其酶學(xué)性質(zhì)，包括最適溫度、最適pH 值、溫度穩(wěn)定性和金屬離子對酶活的影響，為深入理解谷氨酸脫羧酶A 的酶學(xué)性質(zhì)及γ-氨基丁酸的制備提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌DH5α 和BL21 購自美國英杰生物技術(shù)有限公司，其中大腸桿菌DH5α 用于構(gòu)建克隆載體和表達(dá)載體，大腸桿菌BL21 用于編碼谷氨酸脫羧酶A 的基因gadA 的表達(dá)；質(zhì)粒pET-28a（+）購自美國Novagen 公司，用于構(gòu)建表達(dá)載體；質(zhì)粒pTrc99a-gadABC 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[34]，攜帶谷氨酸脫羧酶基因gadA，gadB 和谷氨酸/γ-氨基丁酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因C。

PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、DNA 片段純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒、PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、核酸膠回收試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶BamHI 和SacI，日本TaKaRa 生物工程有限公司；DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Ladder Marker、瓊脂糖凝膠電泳緩沖液、T4DNA 連接酶、蛋白質(zhì)Marker、Ni2+-IDA 瓊脂糖純化樹脂，牛血清白蛋白定量檢測試劑盒、透析袋，上海生工生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂粉、卡那霉素、丹磺酰氯、咪唑、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），杭州匯普生物化學(xué)有限公司；蛋白電泳試劑，上海至源葉生物工程有限公司；L-谷氨酸鈉，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2K15 型高速低溫離心機(jī)，SIGMA 公司；YXQLS-5011 壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SDS-PAGE 電泳系統(tǒng)，北京市六一儀器廠；Gel Doc XR+凝膠電泳儀，BIO-RAD 公司；STS-2 脫色搖床，北京市六一儀器廠；DHL-B電腦數(shù)顯定時恒流泵、BZS-100 型自動部分收集器、層析柱，上海滬西分析儀器有限公司；電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；AF-10 制冰機(jī)，SCOTSMAN 公司；UV-2550 紫外-可見光分光光度計，SHIMADZU 公司。

1.3 培養(yǎng)基

1）LB 液體培養(yǎng)基 酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，pH 7.0。

2）LB 固體培養(yǎng)基 向LB 液體培養(yǎng)基中加入15 g/L 的瓊脂粉。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基 向LB 液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的L-谷氨酸鈉。

4）SOC 培養(yǎng)基 胰蛋白胨20 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉0.5 g/L，氯化鉀2.5 mmol/L，氯化鎂10 mmol/L，葡萄糖20 mmol/L。

1.4 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液及緩沖液

1）0.1 mg/mL 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確稱取1 mg 牛血清白蛋白，充分溶解于0.15 mol/L NaCl 溶液中，定容至10 mL。

2）平衡緩沖液 20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L 氯化鈉，20 mmol/L 咪唑，pH 8.0。

3）結(jié)合緩沖液 20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L 氯化鈉，10 mmol/L 咪唑，pH 8.0。

4）洗脫緩沖液 20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L 氯化鈉，250 mmol/L 咪唑，pH 8.0。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 質(zhì)粒pTrc99a-gadABC 的提取 采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pTrc99a-gadABC，具體步驟參照試劑盒使用說明書。

1.5.2 谷氨酸脫羧酶基因A 的克隆 根據(jù)Gen-Bank 報道的谷氨酸脫羧酶A 的基因序列，設(shè)計引物F1-gadA：5’-TCGCGGATCCATGGACCA GAA GCTGTT-3’ 和R1-gadA：5’-CTTCGAGCTCTTAG GTGTGTTTAAAGCT-3’，進(jìn)行目的基因的PCR 擴(kuò)增，其中劃線部分分別為限制性內(nèi)切酶BamHI 和SacI 的酶切位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)體系為：5×HS 緩沖液10 μL，模板DNA 2 μL，引物F1-gadA 1 μL，引物R1-gadA 1 μL，dNTP 混合物4 μL，Prime Star HS DNA 聚合酶0.5 μL，雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)體系至50 μL。PCR 的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸 （Prime Star HS DNA 聚合酶的延伸速率為1 kb/min，延伸時間根據(jù)目的基因長度確定），35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。若所需要的目的條帶明亮且無雜帶，可直接進(jìn)行PCR 產(chǎn)物回收；若條帶不單一，則進(jìn)行割膠回收。PCR 產(chǎn)物回收的具體步驟參照日本TaKaRa 生物工程有限公司的DNA 純化試劑盒使用說明書。

1.5.3 重組質(zhì)粒pET28a-gadA 的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化將回收的PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28a（+）用限制性內(nèi)切酶BamHI 和SacI 雙酶切，酶切體系如下：目的基因片段gadA 或質(zhì)粒pET28a（+）10 μL，酶切緩沖液2 μL，限制性核酸內(nèi)切酶BamHI 和SacI各1.5 μL，雙蒸水5 μL。將上述反應(yīng)體系放置于37 ℃水浴中酶切3 h 后，用DNA 純化試劑盒對上述2 種酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。

將純化回收后的產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接體系如下：目的基因片段gadA 酶切產(chǎn)物6 μL，質(zhì)粒pET28a（+）酶切產(chǎn)物2 μL，連接緩沖液1 μL，T4DNA 連接酶1 μL。將連接體系置于16 ℃金屬浴中連接12 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中[35]。

大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞的制備參照日本TaKaRa 生物工程有限公司的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒說明書。向制備的感受態(tài)細(xì)胞中加入10 ng 重組質(zhì)粒DNA，輕輕混勻后于冰上放置30 min 后，取出樣品，并置于42 ℃水浴中熱激40 s。熱激后的樣品于冰浴中放置2 min，然后加入1 mL 37 ℃預(yù)熱的SOC 培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)1 h。取適量培養(yǎng)液涂布于篩選平板上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，獲得重組菌株大腸桿菌BL21/pET28a-gadA。

1.5.4 谷氨酸脫羧酶A 的誘導(dǎo)表達(dá) 按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種重組菌株大腸桿菌BL21/pET28a-gadA 至5 mL LB 培養(yǎng)基中 （含100 μg/mL 的氨芐青霉素），37 ℃、220 r/min 搖床培養(yǎng)24 h。再按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量轉(zhuǎn)接至裝液量為50 mL/250 mL 的LB 液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL 的氨芐青霉素）中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至OD600nm值為0.6 時，向培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，并將搖床溫度調(diào)至30 ℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h 后，收集菌體。

1.5.5 粗酶液的制備和鎳柱純化 將離心收集的菌體用蒸餾水洗2 次，重懸于10 mL 裂解緩沖液中 （50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L 氯化鈉，10 mmol/L 咪唑，1 g/L 溶菌酶，pH 8.0），在冰上放置30 min，期間輕輕旋轉(zhuǎn)2 次；細(xì)胞裂解液在4 ℃、15 000 r/min 離心30 min，取上清液；將鎳螯合層析柱顛倒混勻樹脂，并排除貯存緩沖液，將上清液加入鎳柱，棄流出液；用4 mL 漂洗緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L 氯化鈉，20 mmol/L咪唑）洗柱2 次，去除雜蛋白；用1 mL 漂洗緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L 氯化鈉，250 mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗柱2 次，收集含谷氨酸脫羧酶A 的洗脫液。

1.5.6 重組谷氨酸脫羧酶A 的酶學(xué)性質(zhì)

1.5.6.1 pH 值對酶活的影響 配置不同pH 值的酶活測定緩沖液：0.2 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，10 mmol/L 谷氨酸鈉，1 mmol/L 磷酸吡哆醛，分別在pH 3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0 下，于37℃水浴中反應(yīng)10 min 后立即置于沸水浴中終止反應(yīng)，測定樣品中谷氨酸脫羧酶A 的酶活力，以其中最高酶活為100%。

1.5.6.2 反應(yīng)溫度對酶活的影響 取50 μL 適當(dāng)稀釋的純酶液，加入到預(yù)熱的1 mL 酶活測定緩沖液中，分別在20，30，37，40，50 ℃和60 ℃水浴中反應(yīng)10 min，測定樣品中谷氨酸脫羧酶A 的酶活力，以其中最高酶活為100%。

1.5.6.3 金屬離子對酶活的影響 向反應(yīng)體系中加入金屬離子Cu2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+，Co2+和Zn2+，使其終濃度為1 mmol/L。在最適作用pH 值和最適反應(yīng)溫度下，研究金屬離子對谷氨酸脫羧酶A 的酶活力的影響，以不加金屬離子的相對酶活為100%。

1.5.6.4 酶的熱穩(wěn)定性研究 取1 mL 適當(dāng)稀釋的純酶液，分別置于40，50，60 ℃和70 ℃條件下保溫30，60，90，120 min 和150 min，測定不同時間段的谷氨酸脫羧酶A 的酶活力。重組谷氨酸脫羧酶A 在各自溫度下的初始酶活均設(shè)定為100%。

1.6 分析方法

1.6.1 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 樣品中蛋白質(zhì)含量的測定采用BCA 法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品[36]。準(zhǔn)確稱取100 mg 牛血清白蛋白，充分溶解于磷酸緩沖溶液中，定容至100 mL，即得1 mg/mL 的牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照表1分別配置不同質(zhì)量濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。取20 μL 相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液加入到酶標(biāo)板上，立刻加入200 μL 牛血清白蛋白工作液，迅速混勻，在37 ℃水浴中保溫30 min，冷卻至室溫，測定樣品在波長562 nm 處的吸光值，0 號管為對照，繪制蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制Table 1 Preparation of different mass concentrations of standard protein solution

1.6.2 樣品中蛋白質(zhì)含量的測定 在酶標(biāo)板上加入20 μL 樣品溶液（蛋白濃度過高可適當(dāng)稀釋），立即加入200 μL 牛血清白蛋白工作液，迅速混勻，在37 ℃水浴中保溫30 min，冷卻至室溫后，在酶標(biāo)儀上測其在波長562 nm 處的吸光值，對照組加入20 μL 磷酸緩沖液，根據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)量量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算酶液中的蛋白質(zhì)含量。

1.6.3 瓊脂糖凝膠電泳 稱取0.2 g 瓊脂糖加入到配制好的20 mL 1×TBE 電泳緩沖液中，電爐加熱，待瓊脂糖完全溶解后，冷卻數(shù)分鐘。將溶液倒入制膠槽，插上梳子，待凝膠完全凝固后放入到電泳槽中，將樣品和6×上樣緩沖液以2∶1 比例混勻后點(diǎn)樣，在80～120 V 電壓下電泳，結(jié)束后用凝膠成像儀觀察條帶位置。

1.6.4 蛋白質(zhì)SDS-PAGE 電泳 取1 mL 細(xì)胞破碎后的上清液，加入20 μL 的5×上樣緩沖液，并加入80 μL 蒸餾水，震蕩離心管將樣品混勻。沸水浴煮沸5 min。用微量進(jìn)樣器取15 μL 裂解后的粗酶液上樣。電泳時濃縮膠電壓為70 V，分離膠電壓為110 V。待溴酚藍(lán)指示帶跑到膠板底端時結(jié)束電泳。用考馬斯亮藍(lán)染色液染色30 min，再用脫色液快速脫色40 min，最后將凝膠進(jìn)行過夜慢脫色處理至蛋白條帶清晰可見[37]。最后將凝膠置于凝膠成像儀中，拍照并觀察電泳結(jié)果。

1.6.5 谷氨酸脫羧酶A 的酶活測定方法 酶活測定緩沖液配方如下：10 mmol/L 谷氨酸鈉，1 mmol/L磷酸吡哆醛，0.2 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH 4.5[38]。取50 μL 酶液，加入到1 mL 預(yù)熱的酶活測定緩沖液中，37 ℃保溫10 min，然后置于沸水浴10 min 以終止反應(yīng)。高效液相色譜測定反應(yīng)前、后酶活測定緩沖液中生成的γ-氨基丁酸的量。酶活（U）定義：1 min 生成1 μmol γ-氨基丁酸所需的酶量為一個酶活單位。

1.6.6 γ-氨基丁酸和L-谷氨酸鈉的測定 采用高效液相色譜法（HPLC）測定樣品中γ-氨基丁酸和L-谷氨酸鈉的含量，并采用丹磺酰氯衍生化方法[39-40]對樣品進(jìn)行柱前衍生化處理。采用梯度洗脫方法[41-42]對樣品中的物質(zhì)進(jìn)行分離，梯度洗脫條件如表2所示。液相色譜分離柱為安捷倫公司生產(chǎn)的Zorbax Eclipse Plus C18 柱，紫外檢測波長為254 nm，流速為1 mL/min，柱溫控制在30 ℃。鹽相為四氫呋喃、甲醇和50 mmol/L 醋酸鈉緩沖液（pH 6.2）的混合液，體積比為1∶15∶84，有機(jī)相為甲醇。

表2 HPLC 梯度洗脫條件Table 2 The condition of HPLC gradient elution

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 軟件，質(zhì)粒繪圖采用Redasoft Visual Cloning 3.2.3 軟件，數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-谷氨酸鈉、γ-氨基丁酸和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

L-谷氨酸鈉、γ-氨基丁酸和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。由該圖可知，L-谷氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=2×106x+547820，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，x 為L-谷氨酸鈉的質(zhì)量濃度，y 為信號峰面積（圖1a）；γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=5×106x+2×106，相關(guān)系數(shù)R2=0.9978，x 為γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度，y 為信號峰面積（圖1b）；蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=1.2663x+0.0308，其中y 表示在波長562 nm 下蛋白質(zhì)的吸光度；x 表示蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，相關(guān)系數(shù)R2為0.9974（圖1c）。3 條標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，表明自變量與因變量之間的線性關(guān)系良好，可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2 L-谷氨酸鈉、γ-氨基丁酸和蛋白質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of mass concentration of L-monosodium glutamate，γ-aminobutyric acid and protein

2.2 谷氨酸脫羧酶A 基因gadA 的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pTrc99a-gadABC 為模板，采用PCR技術(shù)克隆了編碼谷氨酸脫羧酶A 的基因gadA，將gadA 基因用限制性內(nèi)切酶BamHI 和SacI 雙酶切后，連接到用相同限制性內(nèi)切酶雙酶切的質(zhì)粒pET-28a（+）上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-gadA，構(gòu)建過程如圖3所示。

圖3 質(zhì)粒pET28a-gadA 構(gòu)建過程示意圖Fig.3 Schematic map of the construction of the plasmid pET28a-gadA

將重組質(zhì)粒pET28a-gadA 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，隨機(jī)挑選4 個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 重組質(zhì)粒P1、P2、P3 和P4 的大?。╝）、PCR（b）和雙酶切（c）鑒定結(jié)果Fig.4 Identification results of size （a），PCR （b）and double enzyme digestion （c）of recombinant plasmids P1，P2，P3 and P4

從抗性平板上隨機(jī)挑取4 個轉(zhuǎn)化子，分別提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒命名為P1、P2、P3 和P4。質(zhì)粒大小鑒定結(jié)果如圖4a所示，pET28a 質(zhì)粒大小為5 369 bp，重組質(zhì)粒pET28a-gadA 大小為6 769 bp，圖中P1、P2 和P3 符合預(yù)期大小。圖3b 為PCR 鑒定結(jié)果，gadA 基因?yàn)? 400 bp，從圖中可看出P1、P2和P3 擴(kuò)增出的條帶符合預(yù)期大小。從圖3c 可以看出，雙酶切后目的基因gadA 大小為1 400 bp，pET28a 質(zhì)粒載體大小為5 369 bp，圖中1、2 和3泳道分別有2 個條帶，且符合預(yù)期大小。根據(jù)上述結(jié)果，可以判定質(zhì)粒P1、P2 和P3 構(gòu)建成功。

2.3 谷氨酸脫羧酶A 鎳柱純化

將誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌大腸桿菌BL21/pET28a-gadA 進(jìn)行超聲破碎釋放胞內(nèi)蛋白后，進(jìn)行鎳柱純化，分別測定其蛋白質(zhì)含量和谷氨酸脫羧酶A 的酶活力，結(jié)果如表3所示。純化后的重組谷氨酸脫羧酶A 比酶活為19 U/mg，是粗酶液的4.42 倍，得率為12.8%。

表3 重組谷氨酸脫羧酶A 純化結(jié)果Table 3 Purification results of recombinant glutamate decarboxylase A

2.4 純化的谷氨酸脫羧酶A 的SDS-PAGE 鑒定

純化的谷氨酸脫羧酶A 的SDS-PAGE 鑒定結(jié)果如圖5所示。從該圖可以看出，純化后重組谷氨酸脫羧酶A 為單一的蛋白條帶，且其大小與理論分子質(zhì)量一致，說明其為電泳純級，可用于酶學(xué)性質(zhì)的測定。

圖5 純化的谷氨酸脫羧酶A 的SDS-PAGE 鑒定結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE identification results of the purified glutamate decarboxylase A

2.5 pH 值對谷氨酸脫羧酶A 酶活力的影響

pH 值對谷氨酸脫羧酶A 酶活力的影響如圖6所示。將適量純酶液分別在不同pH 值的緩沖體系下反應(yīng)，測定重組谷氨酸脫羧酶A 的酶活力。從圖中可以看出，pH 值為4.5 時，谷氨酸脫羧酶A的酶活力最高，該結(jié)果與文獻(xiàn)報道的大腸桿菌谷氨酸脫羧酶A 的最適pH 值一致[43-44]。當(dāng)pH 值在4.0～5.0 之間時，谷氨酸脫羧酶A 的相對酶活在75%以上；當(dāng)pH 值為5.0～5.5 時，酶活下降較快；當(dāng)pH 值為6 時，相對酶活僅為10.4%，可見谷氨酸脫羧酶的pH 值活性范圍較窄，說明谷氨酸脫羧酶有較強(qiáng)的pH 值依賴性。

圖6 pH 值對谷氨酸脫羧酶A 酶活力的影響Fig.6 Effects of pH value on the activity of glutamate decarboxylase A

2.6 反應(yīng)溫度對谷氨酸脫羧酶A 酶活力的影響

將適當(dāng)稀釋的純酶液置于pH 4.5 的緩沖液中，在不同溫度下反應(yīng)，研究反應(yīng)溫度對重組谷氨酸脫羧酶A 酶活力的影響，結(jié)果如圖7所示。從該圖可以看出，重組谷氨酸脫羧酶A 的最適溫度50℃，在該溫度下，重組谷氨酸脫羧酶A 的酶活力比大腸桿菌最適生長溫度37 ℃時的酶活力高40%。當(dāng)反應(yīng)溫度從50 ℃升到60 ℃時，酶活力隨著溫度的升高逐漸降低，主要是因?yàn)槊傅鞍椎臒嶙冃允沟貌糠置富顔适隆＿@與Zhao 等[38]報道的大腸桿菌W3110 的谷氨酸脫羧酶A 的最適溫度一致。

圖7 反應(yīng)溫度對谷氨酸脫羧酶A 酶活力的影響Fig.7 Effects of reaction temperature on the activity of glutamate decarboxylase A

2.7 金屬離子對谷氨酸脫羧酶A 酶活力的影響

向反應(yīng)體系中加入金屬離子，如Cu2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+，Co2+和Zn2+，并使其終濃度為1 mmol/L，測定金屬離子對谷氨酸脫羧酶A 酶活力的影響，結(jié)果如圖8所示。從該圖可以看出，Cu2+在低濃度時能明顯抑制谷氨酸脫羧酶A 的酶活力，使其下降到80%左右，這可能是Cu2+與谷氨酸脫羧酶A酶分子中某些官能團(tuán)共價結(jié)合，影響了酶分子活性中心結(jié)構(gòu)所致。Mg2+，Ba2+，Co2+在低濃度時對酶活的影響不大；Ca2+能夠激活谷氨酸脫羧酶A 的酶活力。Snedden 等[45]研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+是谷氨酸脫羧酶最通用的激活劑，能夠激活大部分來源的谷氨酸脫羧酶的酶活力。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)植物GAD 含有一個鈣調(diào)蛋白黏合區(qū)，鈣離子通過此區(qū)域來調(diào)節(jié)谷氨酸脫羧酶的活性[46]。

圖8 金屬離子對谷氨酸脫羧酶A 酶活力的影響Fig.8 Effects of metal ions on the activity of glutamate decarboxylase A

2.8 重組谷氨酸脫羧酶A 的熱穩(wěn)定性

將適當(dāng)稀釋純酶液分別置于不同的溫度下，每隔一定時間測定谷氨酸脫羧酶A 的酶活力，結(jié)果如圖9所示。從該圖可以看出，谷氨酸脫羧酶A在40，50 ℃和60 ℃保溫150 min 后，相對酶活均在40%以上。谷氨酸脫羧酶A 的酶活力在40 ℃時，穩(wěn)定性較好，可以保持63%的活性，然而在70℃時，其活力明顯下降，保溫150 min 后酶活僅能保持17.9%，這表明重組谷氨酸脫羧酶A 熱穩(wěn)定性不高，易于熱失活。

圖9 谷氨酸脫羧酶A 的熱穩(wěn)定性Fig.9 Thermal stability of glutamate decarboxylase A

3 結(jié)論

本研究首先以質(zhì)粒pTrc99a-gadABC 為模板，采用PCR 技術(shù)克隆了編碼谷氨酸脫羧酶A 的基因gadA，然后將該基因與質(zhì)粒pET-28a（+）連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-gadA，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，成功獲得能夠表達(dá)谷氨酸脫羧酶A 的重組大腸桿菌菌株大腸桿菌BL21/pET28agadA。將該菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)后，超聲破碎得粗酶液。通過Ni2+柱親和層析分離純化出目的蛋白谷氨酸脫羧酶A，并對純化的谷氨酸脫羧酶A 進(jìn)行了SDS-PAGE 鑒定。純化結(jié)果表明重組谷氨酸脫羧酶A 的比酶活為19 U/mg，是粗酶液的4.42 倍，得率為12.8%。谷氨酸脫羧酶A 的酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶的酶活力在pH 值為4.5 時最高，具有較強(qiáng)的pH 值依賴性。該酶的最適溫度為50 ℃，在40 ℃時熱穩(wěn)定性最好，70 ℃時穩(wěn)定性較差，此時酶活力僅為初始酶活的17.9%。Cu2+對谷氨酸脫羧酶A 的酶活力具有較強(qiáng)的抑制作用，Ba2+、Co2+和Mg2+對酶活力影響不大，Ca2+能顯著地增加其酶活力。