劉雅潔 王歡歡 張欽鑫 蔣冬暉 史雅文 吳婷 殷敏

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea,OSA）與睡眠期間上呼吸道塌陷有關(guān)，越來(lái)越多的研究提示，引起上呼吸道肌群功能改變的因素在OSA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。舌下神經(jīng)核及舌下神經(jīng)調(diào)控上呼吸道肌，支配伸舌肌如頦舌肌的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元位于腹側(cè)集群，支配縮舌肌如舌骨舌肌的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分布在背側(cè)。睡眠過(guò)程中伸舌肌活性的降低導(dǎo)致上呼吸道傾向于塌陷，引發(fā)打鼾與呼吸暫停。另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)OSA 患者上呼吸道肌肉存在炎性改變和去神經(jīng)病變，這可能提示OSA 也反過(guò)來(lái)影響這些肌群的功能[1]。

5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）又名血清素，是一種生物胺，以其作為神經(jīng)遞質(zhì)的作用而著稱，在調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)，外周血管、腦血管緊張度和血小板功能等方面發(fā)揮作用，并與情緒障礙，嘔吐，偏頭痛，腸易激綜合征以及肺動(dòng)脈和系統(tǒng)性高血壓的病理生理有關(guān)。5-HT 對(duì)呼吸功能具有明顯的中樞興奮作用。5-HT 對(duì)支配上氣道擴(kuò)張肌的舌下神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性刺激。脊髓挫傷所致呼吸功能不全大鼠通過(guò)5-HT 系統(tǒng)可恢復(fù)正常通氣反應(yīng)[2]。而通過(guò)抑制突觸前膜對(duì)5-HT 的再攝取，突觸中5-HT 水平增高，從而減少缺乏單胺氧化酶A 的小鼠的中樞性睡眠呼吸暫停發(fā)作[3]。這些研究都提示5-HT 在睡眠呼吸暫停中可能發(fā)揮保護(hù)性作用[4]。而機(jī)體在正常衰老過(guò)程中，可用的5-HT 受體數(shù)量和5-HT 活性隨年齡的增加而減少，這可能是老年人OSA 發(fā)生率增加的一個(gè)原因[5]。

另一方面，鈣穩(wěn)態(tài)失衡與肌肉疲勞的增加密切相關(guān)。鈣穩(wěn)態(tài)的維持依賴于肌膜、肌漿網(wǎng)和線粒體中存在的復(fù)雜而完整的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，而肌漿網(wǎng)是轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的中心。肌漿網(wǎng)是肌肉中主要的細(xì)胞器，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)游離鈣，在肌肉收縮和舒張中起核心作用。肌漿網(wǎng)鈣ATP 酶（sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-transporting ATPase,SERCA）和蘭尼定受體（ryanodine receptor,RYR）都是Ca2+處理蛋白的成員。骨骼肌中T 膜的去極化產(chǎn)生的膜電位的變化可以誘導(dǎo)二氫吡啶受體的構(gòu)象變化最終引起肌漿網(wǎng)膜上RYR 的活化。RYR 的活化導(dǎo)致鈣離子大量的釋放，鈣離子通過(guò)與肌鈣蛋白結(jié)合引起肌肉的收縮。SERCA 將游離的鈣泵入肌漿網(wǎng)，從而促進(jìn)肌肉松弛。有研究提示，SERCA 功能的改變可能與骨骼肌疲勞有關(guān)[6]。而缺氧可能會(huì)損害SERCA 活性，加劇疲勞的發(fā)展。

基于既往報(bào)道，我們推測(cè)在慢性間歇性低氧（chronic intermittent hypoxia,CIH）背景下頦舌肌的功能改變是OSA 病理生理機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，而在這一環(huán)節(jié)中損傷和代償機(jī)制可能并存。我們的前期工作關(guān)注了5-HT 對(duì)舌下神經(jīng)核的調(diào)節(jié)作用。因此本研究我們關(guān)注舌下神經(jīng)支配的頦舌肌功能變化，以及5-HT 對(duì)其的調(diào)控作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

1 動(dòng)物模型

20只清潔級(jí)健康成年雄性sprague dawley（SD）大鼠（8 周齡，體重180～200g），由江蘇省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)均分為四組，分別為常氧組（control組），以及3 周、5 周和8 周CIH 組。CIH 組大鼠每d 8∶30～16∶30 放置于低氧艙（中國(guó)新飛儀器公司）中飼養(yǎng)，循環(huán)交替給予60s 氮?dú)夂?0s 壓縮空氣，每一循環(huán)120s。同時(shí)用測(cè)氧儀檢測(cè)艙內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)變化，使艙內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)在5%～21%之間循環(huán)。對(duì)照組在常壓、大氣環(huán)境培養(yǎng)艙中飼養(yǎng)，艙內(nèi)氧體積分?jǐn)?shù)維持在21%。每日CIH 造模結(jié)束后將動(dòng)物送入常規(guī)飼養(yǎng)箱。兩組動(dòng)物進(jìn)食、飲水、活動(dòng)均不受限，飼養(yǎng)條件相同。造模分別持續(xù)21d、35d、56d。本實(shí)驗(yàn)方案由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 取材

2.1HE 染色與免疫組化取材

造模結(jié)束后，四組動(dòng)物在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)以2%戊巴比妥鈉（4 mg/100 g）麻醉后固定于手術(shù)木板上，置于解剖盤(pán)中，暴露胸腔并游離出心臟，灌流針經(jīng)左心室插入升主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心房，先用生理鹽水快速灌注5 min（60 ml）左右以移除血液，直到肝臟發(fā)白。然后用4%多聚甲醛400～500 ml 灌注固定，直到動(dòng)物的肝臟發(fā)硬，尾巴僵直，完成灌注。取動(dòng)物頦舌肌，保存在4%多聚甲醛中4℃冰箱儲(chǔ)存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2Western blot 取材

以2%戊巴比妥鈉（4mg/100g）麻醉后立即斷頭，取頦舌肌后，立即置入凍存管中，存放于-80℃冰箱中。

3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

3.1HE 染色

肌肉組織經(jīng)脫水透明后PBS 沖洗，石蠟包埋后切片，橫截面設(shè)為4 μm。經(jīng)過(guò)展片與貼片放于60℃烘箱2h 避免脫片，隨后將切片置于玻片架上后開(kāi)始脫蠟。經(jīng)蘇木素染液7 min，自來(lái)水洗2 min，1%鹽酸酒精2～5s 分化，自來(lái)水洗5～7 min 返藍(lán)，1%伊紅染液2～4 min，自來(lái)水洗1 min。再次將切片按濃度梯度放入70%、80%、90%、95%乙醇1min，無(wú)水乙醇I、無(wú)水乙醇II 各1min，二甲苯I、二甲苯II 各2min，待切片風(fēng)干后中性樹(shù)膠封片，最后在顯微鏡下觀察。

3.2免疫組織化學(xué)

脫蠟前步驟同HE 染色，隨后切片于95℃高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS 沖洗后用免疫組化筆在組織周圍畫(huà)圈，封閉抗原，隨后在圈內(nèi)滴加稀釋好的（1∶100）一抗，置于4℃濕盒中孵育過(guò)夜。放置復(fù)溫，PBS沖洗后滴加稀釋后的二抗，室溫或37℃孵育20～30min。PBS 再次沖洗切片，吸水紙擦干，滴加新鮮配制的DAB 顯色液。顯微鏡下觀察到陽(yáng)性信號(hào)（棕黃色或棕褐色）后水洗終止顯色。蘇木素復(fù)染后再次脫水透明，風(fēng)干后中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察和采集圖像。圖像采用IPP 圖像分析系統(tǒng)分析其平均光密度值（平均光密度值=累積光密度/面積）。

3.3Western Blot

采用GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，即甘油醛-3-磷酸脫氫酶，該酶參與糖酵解反應(yīng)，幾乎在所有組織中都高水平表達(dá)，且表達(dá)量較為恒定，故被廣泛用作實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參）作為內(nèi)參通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法（Western-blot）測(cè)定5-HT 2A 蛋白的表達(dá)量。向組織中加入配制好的裂解液，機(jī)械勻漿后冰上靜置30min，全程冰上操作。4℃，12000 轉(zhuǎn)離心15 min，取上清即可得蛋白樣品，采用CBA 法測(cè)量蛋白樣品的濃度。以1∶4 的比例向蛋白樣中加入蛋白上樣緩沖液，煮蛋白。制備10%SDS-PAGE 凝膠，加樣后開(kāi)始電泳，待蛋白跑至凝膠下方時(shí)將SDS-PAGE 凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后以5%脫脂牛奶震蕩封閉2 h。將條帶放入稀釋好的抗5-HT 2A（1∶500，bs1056R）溶液中，4℃搖床孵育過(guò)夜。TBST 洗滌后放入稀釋后的二抗（HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體）溶液中，震蕩孵育1.5 h。取出條帶，再次TBST 洗滌。避光條件下配制ECL 顯影液，混勻后，均勻滴在PVDF 膜上，使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，任意兩組間比較采用獨(dú)立樣本t-test，趨勢(shì)檢驗(yàn)采用線性回歸分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 頦舌肌HE 染色（圖1）

圖1 頦舌肌HE 染色

與常氧組相比，CIH 組肌纖維及細(xì)胞核排列雜亂，肌纖維分散變細(xì)，肌纖維間隙增大。同時(shí)，CIH 時(shí)間越長(zhǎng)，上述變化越明顯。

2 5-HT 在頦舌肌的表達(dá)（圖2）

圖2 頦舌肌5-HT 免疫組化結(jié)果

與常氧組相比，CIH 各組5-HT 表達(dá)量明顯增高并呈上升趨勢(shì)，并在CIH-8 周組達(dá)到高峰。

3 5-HT 2A 受體的表達(dá)（圖3）

圖3 頦舌肌5-HT 2A 受體免疫組化結(jié)果

5-HT 2A 受體的表達(dá)量在3 周與5 周時(shí)升高并不明顯，但在8 周達(dá)高峰（P<0.01），總體亦呈上升趨勢(shì)。

4 RYR 免疫組化結(jié)果比較（圖4）

圖4 頦舌肌RYR 免疫組化結(jié)果

RYR 表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，在5 周（P＜0.05）、8 周（P＜0.001）時(shí)明顯下降，其中8 周與3 周、5 周組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

5 SERCA 免疫組化結(jié)果比較（圖5）

圖5 頦舌肌SERCA 免疫組化結(jié)果

SERCA 受體表達(dá)量與常氧組比較，在5 周、8周時(shí)均明顯下降（P＜0.001）。

6 5-HT 2A 受體的蛋白表達(dá)量（圖6）

圖6 頦舌肌5-HT 2A 受體蛋白表達(dá)量

5-HT 2A 受體表達(dá)量逐漸增高，與常氧組比較在8 周CIH 時(shí)明顯升高（P＜0.05）。

討論

我們的研究結(jié)果顯示，CIH 組肌纖維及細(xì)胞核排列雜亂，且隨CIH 程度加重變化越明顯。5-HT 及其2A 受體在頦舌肌的表達(dá)水平隨著CIH 時(shí)長(zhǎng)呈增高趨勢(shì)，并在8 周時(shí)達(dá)到高峰。然而鈣離子通道調(diào)控蛋白SERCA 與RYR 的表達(dá)水平則隨CIH 時(shí)長(zhǎng)的增加逐步下降。

一方面，CIH 是造成肌肉損傷的直接原因。有研究表明，慢性缺氧改變了大鼠的呼吸肌肌力和疲勞性，這要么是來(lái)自缺氧的直接影響，要么是來(lái)自缺氧引起呼吸驅(qū)動(dòng)增加所帶來(lái)的適應(yīng)性反應(yīng)的活化增加[7]。另一方面，在CIH 導(dǎo)致的肌肉損傷反過(guò)來(lái)可能加重上氣道的塌陷。Meng 等[8]通過(guò)對(duì)臨界壓力（Pcrit）的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)來(lái)評(píng)估上氣道的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)隨著CIH 的進(jìn)展，上氣道呈現(xiàn)出更高的易坍塌性。

OSA 或CIH 導(dǎo)致肌肉疲勞的潛在機(jī)制尚不清楚。一些研究表明，CIH 導(dǎo)致上呼吸道肌肉纖維從緩慢型轉(zhuǎn)變?yōu)榭焖傩?。CIH 可能會(huì)引發(fā)肌肉纖維組成的變化，這可能是疲勞的特征，但尚存在爭(zhēng)議。Pae等[9]發(fā)現(xiàn)，10h 的間歇性缺氧即可導(dǎo)致頦舌骨肌纖維類型由肌球蛋白重鏈（MHC）2A 轉(zhuǎn)變?yōu)镸HC 2B。CIH 改變了頦舌骨肌的組成和物理特性，使其更易疲勞，這可能是OSA 上呼吸道肌群容易疲勞的肌纖維類型的變化原因。另一個(gè)上氣道擴(kuò)張肌肌肉損傷的機(jī)制可能是通過(guò)氧化應(yīng)激的作用實(shí)現(xiàn)的。Shortt等[10]發(fā)現(xiàn)間歇性缺氧下大鼠膈肌的氧化應(yīng)激導(dǎo)致呼吸肌的耐力受損。第三，疲勞還被認(rèn)為是肌漿網(wǎng)鈣釋放逐漸減少的結(jié)果，其中RYR 與SERCA 在骨骼肌功能的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。在肌纖維中，Ca2+主要儲(chǔ)存在肌漿網(wǎng)末端池內(nèi)，通過(guò)RYR 介導(dǎo)的Ca2+釋放通道釋放，引起肌纖維收縮；Ca2+通過(guò)SERCA 回收到肌漿網(wǎng)內(nèi)，使肌纖維舒張。若缺乏適當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)游離鈣信號(hào)來(lái)激活收縮裝置則會(huì)導(dǎo)致疲勞。SERCA 活性的下降會(huì)導(dǎo)致鈣再攝取的減少，這可使內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+濃度升高，進(jìn)而引起肌間線蛋白的降解，激活蛋白酶和磷脂酶破壞肌肉結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致收縮功能下降；另一方面，由于鈣的再攝取量和速度降低，導(dǎo)致疲勞性增加，從而減緩肌凝蛋白與肌動(dòng)蛋白形成“橋”的解離速度，對(duì)肌肉舒張也產(chǎn)生影響。

在肌漿網(wǎng)鈣釋放減少引起疲勞這一方面，我們的結(jié)果與在4 周CIH 大鼠心肌組織中RYR 及SERCA 表達(dá)水平相似[11]，也發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平隨CIH時(shí)長(zhǎng)的增加后逐步下降。慢性間歇性缺氧類似于心肌出現(xiàn)的缺血再灌注，但骨骼肌與心肌組織的收縮舒張機(jī)制對(duì)Ca2+的依賴性卻不盡相同。一項(xiàng)對(duì)骨骼肌缺血再灌注模型的研究中也發(fā)現(xiàn)了RYR 的表達(dá)下調(diào)，但在早期卻表現(xiàn)出RYR 水平的不變化或升高。這一現(xiàn)象可能與鈣超載及超早期細(xì)胞膜內(nèi)外電荷水平變化有關(guān)，隨著后期細(xì)胞器等的損傷，RYR水平便隨之下降。另有研究也發(fā)現(xiàn)了頦舌肌SERCA水平的下降，且這可能與CIH 的程度及時(shí)程有關(guān)[12]。前文中CIH 研究環(huán)境為5 周，每周5d，而我們的研究環(huán)境分別為3 周、5 周、8 周，每周7d，增加了對(duì)SERCA 變化的動(dòng)態(tài)觀察，對(duì)Ca2+在CIH 的病理機(jī)制中起的作用有了更直觀的了解。

5-HT 與CIH 引起的呼吸中樞損傷密切相關(guān)。中縫核是分泌5-HT 的主要核團(tuán)，腦干呼吸神經(jīng)元支配舌下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核，繼而將呼吸驅(qū)動(dòng)信號(hào)傳遞至舌部肌群[13]，由此，中縫核中5-HT 的降低可能促進(jìn)OSA 的發(fā)生。另外，5-HT 還參與了CIH 大鼠頸動(dòng)脈竇神經(jīng)放電的長(zhǎng)時(shí)程易化作用。在大鼠前包欽格復(fù)合體也發(fā)現(xiàn)了5-HT 及5-HT 2A 參與對(duì)缺氧誘導(dǎo)的呼吸神經(jīng)可塑性調(diào)控的證據(jù)[14]。我們?cè)诩韧芯恐衃15]也發(fā)現(xiàn)了CIH 大鼠舌下神經(jīng)核腹側(cè)核及背側(cè)核5-HT 及5-HT 2A 受體表達(dá)水平的明顯上調(diào)。同時(shí)，5-HT 在肌電活動(dòng)變化中的也起了相應(yīng)作用。5-HT通過(guò)興奮舌下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核使得頦舌肌活性增加的作用與睡眠覺(jué)醒狀態(tài)相關(guān)[16]，從覺(jué)醒到睡眠的過(guò)程中5-HT 的作用隨之減弱，使舌下神經(jīng)向頦舌肌發(fā)放電活動(dòng)減少，最終導(dǎo)致頦舌肌活性下降，引起上氣道阻塞。

目前關(guān)于上呼吸道肌群中5-HT 的研究較少。給麻醉大鼠中樞注射5-HT 及其受體亞型，通過(guò)上氣道肌電活性發(fā)現(xiàn)了5-HT 的維持上氣道肌群穩(wěn)定和預(yù)防咽部塌陷作用[17]。我們的研究直觀地在頦舌肌上發(fā)現(xiàn)了5-HT 及其受體水平的增高。并且，頦舌肌5-HT 在3 周、5 周、8 周CIH 時(shí)都有明顯升高，但5-HT 2A 受體表達(dá)的升高僅但8 周CIH 時(shí)才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，我們考慮增高的5-HT 是由其上游，即舌下神經(jīng)核分泌而來(lái)，而5-HT 2A 受體則由肌肉本身受刺激產(chǎn)生，因此具有一定的延后性。

總的來(lái)說(shuō)，本研究提示慢性間歇性缺氧早期即出現(xiàn)頦舌肌的損傷，表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)和相關(guān)鈣通道調(diào)控蛋白水平的下降，但在一定程度上也存在相應(yīng)的代償性保護(hù)，表現(xiàn)為5-HT 及5-HT 2A 受體水平的升高。在一定階段內(nèi)，5-HT 的代償保護(hù)機(jī)制起著主導(dǎo)作用，舌下神經(jīng)核傳輸更多的5-HT 至下游頦舌肌，通過(guò)產(chǎn)生更多興奮性5-HT 2A 受體，使得肌細(xì)胞興奮性增高、活性增強(qiáng)，從而維持上氣道的不易塌陷，以代償性適應(yīng)上氣道的解剖性狹窄。而這為我們今后的研究提供了方向，即何種程度CIH 造成的損傷可被完全代償，進(jìn)而推導(dǎo)至整體，何種程度OSA 引起的損傷是機(jī)體失代償?shù)拈_(kāi)始，這些探索將對(duì)OSA 疾病的認(rèn)識(shí)具有深遠(yuǎn)意義。