白潤娥， 胡維月， 閆明輝， 劉旭， 楊昊， 閆鳳鳴

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

石楠大孔粉虱Dialeuroporaphotiniana，屬于半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)粉虱亞科(Aleyrodinae)大孔粉虱屬(Dialeuropora)。楊平瀾于1985年首次對(duì)該種進(jìn)行了鑒定，認(rèn)為是一種隸屬于復(fù)孔粉虱亞科Aleurodicinae復(fù)孔粉虱屬Aleurodicus的新種，因采于石楠植物，因而命名為石楠盤粉虱Aleurodicusphotiniana，但沒有見論文發(fā)表和具體的形態(tài)描述。陳連根于1997年詳細(xì)描述了該種的形態(tài)特征、生活史和生物學(xué)特性[1]。石楠大孔粉虱D.photiniana對(duì)寄主植物的危害是多方面的，表現(xiàn)在若蟲、偽蛹和成蟲在寄主植物背面刺吸汁液，使被害葉片發(fā)黃，提早脫落；分泌大量蠟質(zhì)絮狀物影響寄主植物的光合作用，以及若蟲分泌的蜜露誘發(fā)煤污病，嚴(yán)重影響寄主植物的正常生長和景觀效果等[2]。

2006年，DUBEY 和 KO根據(jù)上海植物園保存的標(biāo)本以及陳連根的特征描述將該種歸屬至粉虱亞科(Aleyrodinae)大孔粉虱屬(Dialeuropora)，并將其命名為Dialeuroporaphotiniana(Young)[3]。MARTIN[4]、EVANS[5]、王吉銳[6]也認(rèn)同此觀點(diǎn)。目前國內(nèi)對(duì)于粉虱類昆蟲的研究主要集中在種類鑒定、地理分布、寄主植物以及防治研究等方面，而對(duì)粉虱分類中存在的分歧關(guān)注較少，因此大多研究者仍沿用楊平瀾最初鑒定的種名A.photinianaYoung[1,7-10]。DUBEY和KO對(duì)石楠大孔粉虱歸屬的變更是否正確，有待提出科學(xué)有力的證據(jù)。本文研究了石楠大孔粉虱的偽蛹、成蟲特征，以及分子鑒定結(jié)果，以期對(duì)其分類地位的歸屬提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

石楠大孔粉虱標(biāo)本分別于2016年4月采集于河南省鄭州市鄭東新區(qū)如意路，寄主植物石楠PhotiniaserrulataLindl；2016年7月采集于鄭州大學(xué)新校區(qū)，寄主植物石楠P.serrulata和西府海棠Malusmicromalus；2017年5—7月采集于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)文化路校區(qū)，寄主植物石楠P.serrulata。經(jīng)鑒定并與陳連根保存于上海植物園的玻片標(biāo)本對(duì)比，確定為同一種。

1.2 標(biāo)本的形態(tài)鑒定

粉虱科昆蟲分類所依據(jù)的形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)，在科和亞科水平上主要依據(jù)成蟲和第四齡若蟲(偽蛹)的特征，族、屬和種水平上的分類主要根據(jù)第四齡若蟲的特征進(jìn)行鑒定[7]。

將帶有成蟲的葉片，放入 -20 ℃冰箱冷凍5～10 min，挑取成蟲備用；帶有若蟲的葉片，用軟毛筆輕輕刷去蠟絲，選取第四齡若蟲，備用。將成蟲和第四齡若蟲利用VHX-600超景深顯微鏡(基恩士(中國)有限公司)、S-3400NⅡ掃描式電子顯微鏡(日立(中國)有限公司)進(jìn)行觀察、拍照。

1.2.1 粉虱玻片標(biāo)本的制作 粉虱玻片標(biāo)本制作參照閆鳳鳴[11]，喬魯芹和張小娣[12]，吳杏霞和胡敦孝[13]的玻片制作方法，采用堿液浸泡、染色、酒精梯度脫水和透明等步驟進(jìn)行。

1.2.2 粉虱及粉虱玻片的觀察 用VHX-600超景深顯微鏡在低倍鏡(200倍)下，對(duì)自然狀態(tài)下的粉虱和制作的粉虱玻片標(biāo)本進(jìn)行測量和觀察，并拍照。

1.2.3 偽蛹的觀察 取帶有偽蛹的干燥葉片，在體視顯微鏡下觀察，選用形態(tài)完整偽蛹(如果偽蛹周圍或偽蛹上附著有蠟絲，可以用軟毛筆將蠟絲輕輕刷去)，將其連同葉片剪成小方塊，用導(dǎo)電膠將樣品粘貼在樣品臺(tái)上，選取適當(dāng)?shù)墓ぷ鲄?shù)，用S-3400NⅡ掃描式電子顯微鏡進(jìn)行觀察、掃描并拍照[14-15]。

1.3 標(biāo)本的分子鑒定

1.3.1 石楠大孔粉虱總DNA提取 石楠大孔粉虱總 DNA 的提取參照喬瑋娜等[16]的方法，并稍加改進(jìn)。用軟毛筆挑取單頭粉虱成蟲，置于滴有20 μL提取緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA，1% CTAB，20 mmol·L-1NaCl；pH 8.0)的Parafilm膜上，用0.2 mL PCR管底部作為勻漿器，研磨勻漿，勻漿液移入1.5 mL離心管；用50 μL緩沖液沖洗勻漿器和Parafilm膜4次，移入同一離心管；加入5 μL蛋白酶K(20 mg·mL-1)混勻，置于60 ℃水浴鍋中水浴1 h(中途混勻1次)；加入氯仿和異戊醇(V∶V=24∶1)混合液220 μL，混勻8～10次后，冰浴30 min；在4 ℃條件下，以12 000 r·min-1，離心20 min(德國Hettich D-78532臺(tái)式離心機(jī))，取上清液(約200 μL)，加入440 μL預(yù)冷過的無水乙醇，混勻后 -20 ℃冰箱靜置30 min；取出，4 ℃下以12 000 r·min-1，離心20 min，棄去上清液；加入440 μL預(yù)冷的75%乙醇洗滌，4 ℃ 12 000 r·min-1，離心15 min，棄去上清液。將離心管倒置于潔凈濾紙上，自然干燥20 min，每管加入20 μL超純水，充分溶解后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ陨锓止夤舛扔?jì)測定DNA濃度，以O(shè)D260/280值確定DNA的純度。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 應(yīng)用粉虱類昆蟲 COI 基因的 5′端序列以通用型引物 LCO1490 (5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和 HCO2198 (5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)擴(kuò)增，片段長度約為 710 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。5′端序列擴(kuò)增反應(yīng)體系為 30 μL，其中 ddH2O 23.8 μL，10× buffer 3 μL，10 mmol dNTP 0.6 μL，上游引物和下游引物(10 μmol) 各 0.6 μL，Taq DNA 聚合酶(2.5 U·μL-1, NEB)0.4 μL，模板 DNA 1 μL；PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 10 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物于 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 電泳檢測及序列測定 取5′端 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 5 μL，在含有 Gold view(0.5 μg·mL-1)的1.5%瓊脂糖凝膠上，以100 V電泳分離(電泳緩沖液為 0.5×TBE)45 min 后，以 Gel Doc Universal Hood II 型凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，將經(jīng)電泳檢測驗(yàn)證合格的 PCR 產(chǎn)物直接送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序。將拼接成功的序列錄入中國主要外來入侵昆蟲 DNA 條形碼識(shí)別系統(tǒng)(http://www.chinaias.cn)，其序列登錄號(hào)為(SNDKFS. 2016. 450002. 5. 1-4)。

1.3.4 COI基因序列分析 用DNASTAR軟件讀取序列，并用Chromas軟件查看峰圖校對(duì)序列，確保序列準(zhǔn)確性。以MEGA 5.0 繪制進(jìn)化樹和遺傳距離分析，利用GeneDoc做序列比對(duì)圖，序列來源為中國外來入侵物種數(shù)據(jù)庫(http:// www.chinaias.cn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 成蟲翅脈特征

復(fù)孔粉虱亞科Aleurodicinae和粉虱亞科Aleyrodinae在亞科水平的分類，主要依據(jù)中脈(M)存在，還是肘脈(Cu)存在[7]。選取煙粉虱作為粉虱亞科代表種，與石楠大孔粉虱的翅脈進(jìn)行對(duì)比。

A：石楠大孔粉虱越冬代成蟲；B：石楠大孔粉虱第1～2代成蟲；C：煙粉虱成蟲；

從圖1可以看出，石楠大孔粉虱和煙粉虱成蟲前翅翅脈特征相同，都是肘脈(Cu)存在，中脈(M)消失，與粉虱亞科成蟲特征翅脈相符，從而可以推測：石楠大孔粉虱應(yīng)該歸屬至粉虱亞科。

2.2 第四齡若蟲(偽蛹)形態(tài)特征

石楠大孔粉虱D.photiniana(Young) 偽蛹黃白色，橢圓形，長0.8～1.1 mm，寬0.68～0.82 mm，邊緣較平整，氣門褶明顯，在邊緣處微凹，亞緣區(qū)與背盤區(qū)分界不明顯，頭胸部背面具倒“T”形的羽化縫，橫蛻縫不達(dá)邊緣，縱蛻縫達(dá)邊緣。體背兩側(cè)具4對(duì)蠟腺孔，呈“凹”字形，尾部1對(duì)，呈圓形。皿狀孔半圓形，舌狀突伸出，呈十字形，蓋片近梯形(圖2，圖3)。從電鏡圖片觀察可知，偽蛹的十字形舌狀突呈毛絨狀，但沒有明顯的舌狀突長剛毛；背孔和尾孔都是單孔(圖3)。

A：偽蛹生態(tài)圖；B：偽蛹玻片圖；C：背部孔。

A：偽蛹；B：皿狀孔；C：背部孔；D：尾部孔。

2.3 石楠大孔粉虱與復(fù)孔粉虱屬和大孔粉虱屬代表種偽蛹特征的比較

粉虱科昆蟲在屬和種水平上的分類主要根據(jù)第四齡若蟲(偽蛹)的特征進(jìn)行鑒定。將石楠大孔粉虱偽蛹(圖4A)與復(fù)孔粉虱屬代表種螺旋粉虱AleurodicusdispersusRussell(圖4B)和大孔粉虱屬代表種土密大孔粉虱Dialeuroporabrideliae(Takahashi)(圖4C)的偽蛹特征進(jìn)行比較分析。觀察標(biāo)本可知,石楠大孔粉虱有5對(duì)簡單孔，亞緣區(qū)4對(duì)尾部1對(duì)；土密大孔粉虱有5對(duì)簡單大孔，分布在亞緣區(qū)；螺旋粉虱有5對(duì)復(fù)合孔，4對(duì)在腹部，1對(duì)在胸部。石楠大孔粉虱舌狀突十字形，無剛毛；螺旋粉虱舌狀突舌狀，有剛毛；土密大孔粉虱舌狀突幾乎被蓋片覆蓋，無剛毛。

A：石楠大孔粉虱；B：螺旋粉虱；C：土密大孔粉虱。

據(jù)《中國粉虱志》的描述，復(fù)孔粉虱屬偽蛹的基本特征是蛹?xì)んw背亞背區(qū)有5～7對(duì)能產(chǎn)生蠟絲的復(fù)合孔，1對(duì)在頭部，其余在腹部，分泌的蠟絲粗壯、長，并纏繞在一起，舌狀突呈舌狀，延伸至皿狀孔后緣，舌狀突上有4根明顯的剛毛，有時(shí)只有2根剛毛；大孔粉虱屬偽蛹特征是亞緣區(qū)具有1～5對(duì)大圓孔。舌狀突形狀多變，不為舌狀，舌狀突上無明顯剛毛，皿狀孔內(nèi)部平滑，蓋片覆蓋整個(gè)孔[7]。這2個(gè)屬最重要的區(qū)別是孔的形狀、數(shù)量、位置及舌狀突上是否有剛毛。

依據(jù)2個(gè)屬的屬特征、以及代表種特征，從孔的數(shù)量、位置及形狀以及舌狀突的形狀分析，石楠大孔粉虱符合大孔粉虱屬的特征，應(yīng)該歸屬至大孔粉虱屬。

利用5′端特異引物對(duì)標(biāo)本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測，結(jié)果顯示在700 bp附近可見清晰的目標(biāo)條帶(圖5)，測序結(jié)果顯示新擴(kuò)增序列長度為680 bp。將所得序列與中國外來入侵物種數(shù)據(jù)庫(http:// www.chinaias.cn)中已經(jīng)公布的粉虱COI基因序列(共計(jì)6屬27條序列，詳見表1)進(jìn)行序列比對(duì)、以及進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育分析，以此探究石楠盤粉虱的分類地位。

M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 泳道1～5: 石楠大孔粉虱; 6: 陰性對(duì)照(水)。

表1 用于DNA條形碼技術(shù)研究的粉虱種類Table 1 Species of whitefly used in DNA barcoding studies

序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示(圖6，圖7)，18種粉虱來源的27條序列可聚類為6個(gè)亞群，Dialeuropora來源的12個(gè)序列(seq6440、seq6441、seq6442、seq6443、seq6444、seq6445、seq6446、seq6447、seq6448、seq6449、seq6450和seqx)歸類為group 1，Aleuroclava來源的4個(gè)序列(seq4193、seq4198、seq4199、seq4200)歸類為group 2，Bemisiatabaci來源的2個(gè)序列(seq5912、seq6144)為group 3，Aleuroclava來源的7個(gè)序列(seq4178、seq4180、seq4181、seq4184、seq4185、seq4186和seq4187)為group 4，Aleurolobus來源的1個(gè)序列(seq4204)歸為group5，Metabemisia來源的1個(gè)序列(seq6458)與上述序列遺傳距離最遠(yuǎn)，單獨(dú)歸類為group 6。

圖6 18種粉虱COI基因5′端序列比對(duì)分析

注：節(jié)點(diǎn)附近的數(shù)字代表節(jié)點(diǎn)支持率(>50)；標(biāo)尺示遺傳距離。Note: The number represents node support rate (>50); the scale shows the genetic distance.圖7 NJ法(A)構(gòu)建的18種粉虱系統(tǒng)發(fā)育樹

其中新克隆的seqXDialeuroporaphotiniana(Young)與Dialeuropora類來源序列相似度最高，介于76.7%～86.5%，與已知香港裸粉虱Dialeurodeshongkongensis基因序列相似度最高，相似度從高到低依次為seq6446、seq6445、seq6440、seq6441、seq6442、seq6448、seq6444、seq6443、seq6447、seq6449和seq6450，因此將該序列歸為Dialeuropora的group1。從分子鑒定角度分析，支持石楠大孔粉虱歸屬大孔粉虱屬。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果顯示石楠大孔粉虱前翅肘脈(Cu)存在，中脈(M)消失，成蟲翅脈符合粉虱亞科的特征；蛹?xì)け趁嬖趤喚墔^(qū)分布有蠟腺孔5對(duì)，并且都是簡單的大孔，而不是復(fù)合孔；孔數(shù)量、形狀、位置以及舌狀突無剛毛的特征都與大孔粉虱屬相符。從分子鑒定結(jié)果分析，其序列長度、遺傳距離和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系均歸類為Dialeuropora的group1，支持石楠大孔粉虱歸屬大孔粉虱屬。本研究結(jié)果充分印證變更石楠盤粉虱AleurodicusphotinianaYoung分類歸屬的科學(xué)性，確定其歸屬粉虱亞科Aleyrodinae大孔粉虱屬Dialeuropora，種名為Dialeuroporaphotiniana，中文名為石楠大孔粉虱。MARTIN[4]認(rèn)為，陳連根的描述是確定其分類地位的依據(jù)，因此，他認(rèn)為該種只在中國分布，該種的定名人應(yīng)為Chen，即該種學(xué)名為DialeuroporaphotinianaChen。但楊平瀾先生(P. Young)是粉虱分類專家，其鑒定該新種并給予命名(盡管沒有發(fā)表)的貢獻(xiàn)應(yīng)予肯定，而陳連根對(duì)于該種形態(tài)特征的詳盡描述也對(duì)該種的鑒定和鑒別同樣重要。因此，本研究支持定名人為2人，沿用學(xué)名Dialeuroporaphotiniana(Young et Chen)。