宋文菲, 盧煥仙, 黃新球, 荀利杰, 余玉生, 李亞輝, 王艷輝

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所, 云南 蒙自 661101;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 云南 昆明 650201)

西方蜜蜂Apismellifera是中國(guó)的一種重要傳粉昆蟲(chóng)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有不可替代的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。在人類(lèi)可利用的1 330種作物中，約有1 100多種需要蜜蜂進(jìn)行授粉[1]。蜂蜜是蜜蜂采集植物花蜜后釀造的一種天然糖類(lèi)物質(zhì)，主要成分包括單糖類(lèi)(果糖和葡萄糖)和水[2]，蜂蜜在維持蜂群的繁育、行為學(xué)和級(jí)型分化中發(fā)揮了極其重要的作用[3]。蕎麥蜜是中國(guó)重要的單花蜜之一，研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥蜜的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和酚類(lèi)物質(zhì)明顯高于其它大宗單花蜂蜜[4-5]，蕎麥蜜多酚粗提物和各級(jí)份在化學(xué)體系和細(xì)胞抗氧化體系具有一定的清除作用，在人類(lèi)保健中具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[6]。在蜜蜂飼養(yǎng)中，為了促進(jìn)蜂群繁育，會(huì)對(duì)蜂群進(jìn)行補(bǔ)充飼喂和獎(jiǎng)勵(lì)飼喂，從而保證蜂巢內(nèi)有充足的飼料儲(chǔ)備，以及調(diào)動(dòng)工蜂的哺育能力和采集能力，通常采用蜂蜜與50%蔗糖水進(jìn)行飼喂[7-8]。除食物對(duì)蜂群繁育有直接影響外，蜜蜂體內(nèi)的壽命基因也對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和壽命起到一定的調(diào)控作用。工蜂壽命調(diào)節(jié)與保守的卵黃原蛋白(Vitellogenin,Vg)基因有關(guān)，蜜蜂的Vg基因在蜂王和長(zhǎng)壽工蜂中維持了較高的水平[9]；Vg主要在蜜蜂的胸部和頭部脂肪體細(xì)胞中表達(dá)，老齡蜂王的Vg基因水平比工蜂高[10]。沉默信息調(diào)節(jié)子2(Silent information regulator 2, Sir2)蛋白是一類(lèi)存在于古生菌到哺乳動(dòng)物中高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴(lài)性去乙酰化酶。研究發(fā)現(xiàn)壽命基因Sir2在蜂王的表達(dá)水平顯著高于工蜂，表明Sir2基因是類(lèi)蜂王基因，是影響蜜蜂壽命的重要基因之一[11]。另外，Sir2基因從限制熱量的代謝方面調(diào)節(jié)細(xì)胞的衰老進(jìn)程[12-13]?；谑w麥蜜提取液在細(xì)胞抗氧化體系中具有一定的清除作用，目前尚無(wú)蕎麥蜜提取物質(zhì)對(duì)蜜蜂存活及壽命基因的研究報(bào)道。本研究采用蕎麥蜜的4種提取液飼喂西方蜜蜂，分析提取液對(duì)成年工蜂的存活率，以及對(duì)Vg和Sir2壽命基因相對(duì)表達(dá)量的影響，旨在為蜜蜂飼養(yǎng)中篩選利于蜂群繁育的飼喂物質(zhì)，探討蕎麥蜜提取液與工蜂Vg和Sir2基因的相互關(guān)系，為蜜蜂的飼養(yǎng)和繁育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 化學(xué)試劑 Trizol提取液、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser RT-qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green Premix Ex Taq II(均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)，DEPC水(購(gòu)自北京索萊寶有限公司)。

1.1.2 主要儀器 NanoDrop 2000型分光光度計(jì)(Thermo Scientific)、StepOnePlusTM型qPCR儀(Applied Biosystems公司)、梯度PCR儀(Applied Biosystems公司)、低溫高速離心機(jī)(德國(guó) Sigma公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、HWS智能型恒溫恒濕箱(寧波江南儀器廠)。

1.2 蕎麥蜜提取液的制備

采用本實(shí)驗(yàn)室建立的方法制備蕎麥蜜提取液，具體步驟為：稱(chēng)取300 g蕎麥蜜于500 mL燒杯中，加入100 mL蒸餾水，混勻后轉(zhuǎn)入1 000 mL分液漏斗中，加入100 g石油醚，充分混勻后靜置分層，取上層液于50 mL離心管中，5 000 r·min-1離心10 min，取上層液于500 mL蒸餾燒瓶中，下層液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，分別用100 mL石油醚重復(fù)提取2次，合并上層液于蒸餾燒瓶中，40 ℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干，加入10 mL蒸餾水在蒸餾燒瓶中，超聲混勻后40 ℃濃縮至干備用。下層液加入100 mL乙酸乙酯，重復(fù)提取3次，上層有機(jī)相合并于另一500 mL蒸餾燒瓶中，40 ℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干，加入10 mL蒸餾水在蒸餾燒瓶中，超聲混勻后40 ℃濃縮至干備用。重復(fù)此步驟，逐步加入正丁醇、乙腈，得到蕎麥蜜正丁醇、乙腈提取物。將4種提取物(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙腈)用30 g 50%的蔗糖水分3次移到塑料瓶中，超聲助溶，加入50%的蔗糖水至250 g，分別得到蕎麥蜜的4種提取液。

1.3 蕎麥蜜提取液對(duì)不同日齡成年工蜂存活率的影響

試蟲(chóng)采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所飼養(yǎng)的西方蜜蜂蜂群。把剛出房的1日齡成年幼蜂放入飼養(yǎng)盒(26 cm×18 cm×9 cm)，飼養(yǎng)盒置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(溫度27 ℃，相對(duì)濕度62%，黑暗條件)。將1.2中制備好的蕎麥蜜提取液分別放入飼料盒中供成年幼蜂自由取食，從2019-08-07開(kāi)始飼養(yǎng)，以400只成年幼蜂作為1個(gè)處理，重復(fù)3次，于2019-08-16(10日齡)進(jìn)行成年工蜂死亡數(shù)的統(tǒng)計(jì)，每隔5 d統(tǒng)計(jì)1次，至2019-09-09結(jié)束，統(tǒng)計(jì)不同日齡成年工蜂的存活率。

1.4 蕎麥蜜提取液對(duì)不同日齡成年工蜂Vg和Sir2基因相對(duì)表達(dá)量的影響

1.4.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 從1.3各提取液中選取不同日齡(16、27、34日齡)活體成年工蜂，采用50%糖水飼喂100頭1日齡成年幼蜂，取16、27、34日齡活體成年工蜂作為對(duì)照樣本(CK)，用液氮凍斃，各處理均以3只成年工蜂頭部為1個(gè)生物學(xué)樣本，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用Trizol法提取總RNA，取1 μL RNA測(cè)定其濃度及OD值(A260/A280)，要求OD值在1.8～2.1之間，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，獲得的cDNA 在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物設(shè)計(jì)及合成 采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

1.4.3 qPCR熒光試驗(yàn) qPCR熒光反應(yīng)總體系為20 μL：TB Green Premix Ex Taq II：10 μL；PCR primer(F+R)(10 μmol·L-1)：1.6 μL；ROX Reference Dye(50倍)：0.4 μL；cDNA：2 μL；dH2O(滅菌蒸餾水)：6 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，10 min；95 ℃，15 s，57 ℃，1 min(40個(gè)循環(huán))；添加溶解曲線。設(shè)置3個(gè)水平重復(fù)孔。熒光驗(yàn)證時(shí)選擇Gapdh作為內(nèi)參基因，計(jì)算ΔCt(測(cè)試樣本)=Ct(目標(biāo))-Ct(內(nèi)參)，ΔCt(對(duì)照樣本)=Ct(目標(biāo))-Ct(內(nèi)參)，ΔCt=ΔCt(測(cè)試樣本)-ΔCt(對(duì)照樣本)，相對(duì)表達(dá)量=2-ΔCt。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0軟件中單因素方差分析，LSD多重比較，分析不同處理、不同日齡成年工蜂之間基因相對(duì)表達(dá)量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕎麥蜜提取液對(duì)不同日齡成年工蜂存活率的影響

從圖1可看出，隨著日齡增加成年工蜂的存活率呈逐漸下降的趨勢(shì)，蕎麥蜜不同提取液對(duì)其存活率存在一定差異。0號(hào)(石油醚提取液)飼喂的成年工蜂各日齡存活率最低，至35日齡存活率僅為31.46%。其他3種蕎麥蜜提取液(1～3號(hào))飼喂的成年工蜂存活率在10～25日齡期間基本一致，其存活率均在77.44%以上，25日齡后存活率急劇下降，以2號(hào)(正丁醇提取液)飼喂的成年工蜂存活率最高，至35日齡存活率仍維持在56.27%，1號(hào)和3號(hào)提取液在35日齡時(shí)存活率分別為38.84%和32.71%。這表明蕎麥蜜正丁醇提取液對(duì)成年工蜂的存活率最為有利，在10～25日齡采取蕎麥蜜正丁醇提取液進(jìn)行飼喂，可維持成年工蜂較高的存活率，有利于蜂群繁育。

注：0號(hào)：蕎麥蜜石油醚提取液；1號(hào)：蕎麥蜜乙酸乙酯提取液；2號(hào)：蕎麥蜜正丁醇提取液；3號(hào)：蕎麥蜜乙腈提取液。

2.2 蕎麥蜜提取液對(duì)不同日齡成年工蜂Vg基因相對(duì)表達(dá)量的影響

從圖2可看出，16日齡時(shí)，1～3號(hào)蕎麥蜜提取液飼喂成年工蜂后其體內(nèi)Vg相對(duì)表達(dá)量較CK相比均顯著下調(diào)(P<0.05)。27日齡時(shí)，1～3號(hào)試驗(yàn)組的Vg相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05)。其中，3號(hào)(乙腈提取液)的Vg相對(duì)表達(dá)量最高，是CK的2.81倍，與其余3個(gè)試驗(yàn)組達(dá)到極顯著差異(P<0.01)。至34日齡時(shí)，1～3號(hào)試驗(yàn)組的Vg基因相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，其中1、2號(hào)試驗(yàn)組與CK達(dá)到極顯著差異(P<0.01)。這表明隨著日齡的增加，1～3號(hào)試驗(yàn)組成年工蜂體內(nèi)Vg基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。

注：1號(hào)：蕎麥蜜乙酸乙酯提取液；2號(hào):蕎麥蜜正丁醇提取液；3號(hào):蕎麥蜜乙腈提取液；CK為50%糖水。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

由圖3可看出，16日齡時(shí)，1～3號(hào)蕎麥蜜提取液飼喂成年工蜂后其體內(nèi)Sir2相對(duì)表達(dá)量較CK相比均極顯著上調(diào)(P<0.01)。其中，3號(hào)(乙腈提取液)的Sir2相對(duì)表達(dá)量最高，與CK相比上升了2.03倍，極顯著高于其他3個(gè)試驗(yàn)組(P<0.01)。27日齡時(shí)，1～3號(hào)試驗(yàn)組的Sir2相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)，其中 3號(hào)(乙腈提取液)的Sir2相對(duì)表達(dá)量最低，是CK的0.24倍，顯著低于其他3個(gè)組(P<0.05)。至34日齡時(shí)，與CK相比，1～3號(hào)試驗(yàn)組都極顯著下調(diào)(P<0.01)。表明隨著日齡的增加，1～3號(hào)試驗(yàn)組成年工蜂體內(nèi)Sir2基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

由于在蜜蜂養(yǎng)殖中人類(lèi)對(duì)蜂巢內(nèi)蜂蜜定期采集，在蜜源匱乏季節(jié)易出現(xiàn)食物短缺問(wèn)題，對(duì)蜜蜂的繁育、抵抗力等造成不利影響[1,3]。蜂蜜是維持蜜蜂生長(zhǎng)發(fā)育的基本的物質(zhì)之一，蜜蜂養(yǎng)殖中常采用蜂蜜與50%蔗糖水混合后作為蜂群的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充[7-8]。本研究表明，3種蕎麥蜜提取液(乙酸乙酯、正丁醇、乙腈)飼喂的成年工蜂在10～25日齡期間維持了較高的存活率。說(shuō)明隨著蕎麥蜜提取過(guò)程的深入，3、4級(jí)提取液(正丁醇、乙腈)對(duì)10～25日齡成年工蜂的存活率高于1、2級(jí)提取液(石油醚、乙酸乙酯)。推測(cè)可能與蕎麥蜜中含有抗氧化活性的成分，其粗提物在細(xì)胞抗氧化體系具有一定的清除作用有關(guān)[6]，但蕎麥蜜提取液如何參與蜜蜂抵御外界不良環(huán)境影響還需要進(jìn)一步研究。蕎麥蜜不同提取液飼喂的成年工蜂在25日齡后存活率急劇下降，表明成年工蜂進(jìn)入衰老期，食物對(duì)其存活率的調(diào)控作用較小，但35日齡時(shí)蕎麥蜜正丁醇提取液飼喂的成年工蜂存活率仍維持在56.27%，建議在成年工蜂10～25日齡采取蕎麥蜜正丁醇提取液進(jìn)行飼喂，可維持成年工蜂較高的存活率，有利于蜂群繁育。

圖3 蕎麥蜜提取液對(duì)不同日齡成年工蜂Sir2相對(duì)表達(dá)量的影響

不同級(jí)型蜜蜂的生長(zhǎng)發(fā)育和壽命除受到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)外，還與其體內(nèi)的基因調(diào)控有密切關(guān)系[14]。本研究表明，3種蕎麥蜜提取液在成年工蜂16～27日齡時(shí)，與CK相比Vg相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05)，至34日齡時(shí)，Vg相對(duì)表達(dá)量均下降，呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，蜜蜂體內(nèi)的保幼激素(Juvenile hormone, JH)升高會(huì)抑制卵黃形成，導(dǎo)致Vg滴度降低[10]，JH滴度在成年工蜂2～3周(哺育蜂)內(nèi)較低，在采集蜂中的JH滴度較高，而血淋巴中的Vg水平與JH滴度正好相反[15-16]。表明成年工蜂體內(nèi)的Vg相對(duì)表達(dá)量可能受到蜜蜂行為發(fā)育中JH滴度水平的影響。3種蕎麥蜜提取液在16～34日齡時(shí)，與CK相比Sir2相對(duì)表達(dá)量均處于下調(diào)狀態(tài)，這與Sir2在釀酒酵母、秀麗隱桿線蟲(chóng)、黑腹果蠅中通過(guò)熱量限制模式對(duì)生物體壽命發(fā)揮調(diào)控作用[17]的結(jié)果不一致。Sir2p是促進(jìn)釀酒酵母壽命的限制性成分，增加基因拷貝數(shù)可以延長(zhǎng)野生型細(xì)胞的壽命[18]；秀麗隱桿線蟲(chóng)Sir-2.1通過(guò)下調(diào)胰島素信號(hào)通路發(fā)揮延長(zhǎng)壽命的作用[19]，推測(cè)可能與Sir2在不同物種間的調(diào)控機(jī)理差異所致。