張華偉,董作祥,蔡學(xué)昌,盧東林,劉恒健,孫鵬

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,山東 青島 266003)

我國已進(jìn)入老齡化社會，到目前為止我國老齡人口接近3億，并以每年3%的速度遞增。隨著老齡人口增加，各種衰老相關(guān)疾病的發(fā)病人數(shù)也明顯增加，給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。其中包括腦小血管相關(guān)的疾病，如腦出血、腦梗死以及認(rèn)知障礙和癡呆等[1-2]。腦小血管包括腦小動脈、小靜脈和毛細(xì)血管，它們均在腦微循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[3]，其中以腦小動脈的作用最為重要，因為腦小動脈與星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共同組成神經(jīng)血管單位，從而控制和協(xié)調(diào)局部腦血流和阻力[4]。當(dāng)腦小動脈結(jié)構(gòu)和功能改變時，必然影響到腦實質(zhì)的血流動力學(xué)參數(shù)，繼而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血-腦脊液屏障破壞、炎性滲出以及神經(jīng)損傷等。大量研究表明，衰老是多種重要生理功能減退的結(jié)果，同時也是諸多腦小血管相關(guān)疾病的危險因素，隨著衰老，腦小血管相關(guān)疾病的風(fēng)險也相應(yīng)增加[5]，但其發(fā)病機制仍然不是很清楚。本研究通過探討衰老對腦小動脈的結(jié)構(gòu)和收縮功能影響，從而為衰老導(dǎo)致的腦小血管相關(guān)疾病發(fā)病機制的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雄性12周齡SD大鼠(體質(zhì)量約345 g)30只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，隨機分為年輕組和老年組，每組15只，均飼養(yǎng)于SPF級動物實驗中心。實驗藥品包括NaCl、KCl、NaHCO3、CaCl2、MgSO4、HEPES、NaH2PO4和葡萄糖，全部購自于美國Sigma公司。生理鹽溶液(PSS)內(nèi)含：119.0 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、18.0 mmol/L NaHCO3、5.0 mmol/L HEPES、1.2 mmol/L MgSO4、1.6 mmol/L CaCl2、10.0 mmol/L葡萄糖、1.2 mmol/L NaH2PO4,使用前將pH值調(diào)整為7.4。無鈣生理鹽溶液(PSS0Ca，除不含CaCl2以及增加0.03 mmo/L EDTA之外，其他成分和PSS相同)，使用前也需將溶液pH值調(diào)整為7.4[6-7]。SZ2體視鏡、IMT-2倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；CH-1 Living system(美國Living systems公司，是一套可以模擬體內(nèi)生理環(huán)境，保持離體血管活性和生理功能的裝置)，由以下部分組成：可以固定血管的小水槽，壓力控制器(調(diào)節(jié)離體血管腔內(nèi)的壓力)，溫控裝置(維持離體血管溫度37 ℃左右)，供氧系統(tǒng)(維持相對穩(wěn)定的氧氣含量)，圖像采集和顯示器(實時采集和放大血管圖像并對血管內(nèi)外徑進(jìn)行測量)。

1.2 實驗方法

1.2.1動物模型制備 兩組大鼠均自由進(jìn)食及飲水，避免刺激引起應(yīng)激反應(yīng)，人工照明控制晝夜節(jié)律各為12 h。年輕組大鼠飼養(yǎng)到15周齡、老年組大鼠飼養(yǎng)到65周齡時進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2麻醉及取腦 實驗前大鼠在安靜環(huán)境下休息60 min，稱質(zhì)量后經(jīng)腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉(50 mg/kg體質(zhì)量)麻醉。待大鼠角膜反射和疼痛反射消失后斬頭，剪開頭頂皮膚，用咬骨鉗分離顱骨，取出大腦，置于冰上預(yù)冷的充滿PSS0Ca的玻璃皿中。

1.2.3腦小動脈分離及其在Living system中的安裝和固定 在體視鏡下用小剪刀沿大腦中動脈(MCA)周圍剪開腦組織，取出一塊大小約4 mm×7 mm、包含MCA M1段(長度約為2.5 mm)的腦組織，置于另一充滿PSS0Ca的玻璃皿中。小心分離出MCA M1段深入腦實質(zhì)的小動脈，將其轉(zhuǎn)移至Living system小水槽中，小水槽中充滿PSS[8-9]。用尖頭鑷子將腦小動脈一端套在小水槽的玻璃管上，再用6號外科縫線中的單根棉線將其固定，另一端固定在對側(cè)玻璃管上。將小水槽轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡下并通入混合氣體(其中含體積分?jǐn)?shù)0.21的O2和0.06的CO2,0.73的N2)，連接控溫裝置和加壓裝置，使水槽溫度維持在37 ℃，小動脈管腔內(nèi)充滿PSS并將灌注壓維持在1.3 kPa。

1.2.4圖像描記和血管內(nèi)外徑測量 圖像采集系統(tǒng)采用高分辨率黑白相機，在顯示器上小動脈管壁因為透光性差而呈現(xiàn)灰黑色，管腔呈現(xiàn)灰白色，根據(jù)色差以兩側(cè)血管壁的灰黑色外邊界為基準(zhǔn)測量血管外徑，以兩側(cè)血管壁黑色內(nèi)邊界為基準(zhǔn)測量血管內(nèi)徑。在含鈣的情況下，待溫度上升到37 ℃時，按上述方法測量血管內(nèi)徑和外徑初始值。等待25～30 min，使血管恢復(fù)活力并收縮穩(wěn)定，依次升高灌注壓到1.3、2.7、4.0、5.3、6.7、8.0 kPa，每次升高灌注壓后維持3 min，測量有鈣情況下血管內(nèi)徑和外徑值。有鈣情況下血管內(nèi)徑測量結(jié)束后，將灌注壓降到0.7 kPa,以PSS0Ca置換小水槽中的PSS，反復(fù)洗滌6～8次直到血管不再收縮。待溫度恢復(fù)到37 ℃后，再次測量灌注壓分別為0.7、1.3、2.7、4.0、5.3、6.7、8.0 kPa時的血管內(nèi)徑和外徑，為無鈣情況下血管內(nèi)徑(ID0Ca)和外徑(OD0Ca)。

1.2.5血管結(jié)構(gòu)參數(shù)計算[10-14]管壁厚度(μm)=(OD0Ca-ID0Ca)/2;橫截面積(μm2)=(π/4)×(OD0Ca-ID0Ca);管壁厚度與管徑之比=管壁厚度/ID0Ca;管壁應(yīng)力(σ)=(P×ID0Ca)/2×管壁厚度，式中的P為血管內(nèi)灌注壓;管壁應(yīng)變(ε)=(ID0Ca-ID0Ca 0.7 kPa)/ID0Ca 0.7 kPa。

血管硬化程度和剛度由彈性模量(E=σ/ε)來反映，彈性模量由應(yīng)力-應(yīng)變曲線來表示。應(yīng)用Microsoft Office Excel軟件中最小二乘法對每一根血管對應(yīng)的兩組數(shù)據(jù)(不同壓力下對應(yīng)的系列血管應(yīng)變值及系列血管應(yīng)力值)進(jìn)行指數(shù)曲線擬合，擬合模型σ=σ初始eβε，σ初始為壓力在0.7 kPa時初始內(nèi)徑對應(yīng)的σ值。擬合后每一根血管對應(yīng)生成一條擬合曲線方程式，方程式中包含確切的σ初始值和β值，將σ初始值和β值的平均值代入擬合模型，并最終得到代表各組應(yīng)力-應(yīng)變的綜合方程式及對應(yīng)曲線。擬合曲線中β值為對應(yīng)曲線的斜率，反映彈性模量的大小，β值增加代表血管剛度和硬化程度增加[13-16]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 腦小動脈內(nèi)外徑隨灌注壓升高的變化

有鈣情況下，年輕組和老年組腦小動脈初始血管內(nèi)徑分別為(25.50±4.20)、(25.67±3.60)μm,兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.79,P>0.05)。灌注壓從1.3 kPa升高到8.0 kPa的過程中，血管表現(xiàn)為主動收縮，血管內(nèi)徑組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組別=10.12,P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F灌注壓=11.90,P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=36.36,P<0.05)；單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在5.3、6.7、8.0 kPa時，老年組的血管內(nèi)徑大于年輕組(t=3.89～5.06,P<0.05)。見圖1A和1B。血管外徑組間比較差異有顯著意義(F組別=10.29,P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F灌注壓=6.81,P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=17.99,P<0.05)；單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在5.3、6.7、8.0 kPa時，老年組的血管外徑大于年輕組(t=3.82～4.72,P<0.05)。見圖1C。血管內(nèi)徑變化百分比組間比較差異亦有顯著意義(F組別=24.00，P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F灌注壓=5.92，P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=15.48，P<0.05)；單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在4.0～8.0 kPa時，老年組血管內(nèi)徑增加百分比大于年輕組(t=5.08～7.11,P<0.05)，隨著灌注壓升高，老年組血管持續(xù)擴張，而年輕組的血管先收縮，到6.7 kPa時才出現(xiàn)擴張。見圖1D。

在無鈣情況下，兩組在灌注壓從0.7 kPa升高到8.0 kPa的過程中，血管表現(xiàn)為被動擴張，血管內(nèi)徑組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組別=7.83，P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F灌注壓=176.60，P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=14.45，P<0.05)；單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，在0.7、1.3、2.7 kPa時，老年組的血管內(nèi)徑大于年輕組(t=3.23～3.86,P<0.05)。見圖1E。血管外徑組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組別=17.85,P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F灌注壓=127.80,P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=14.15,P<0.05)；單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在0.7～8.0 kPa時，老年組的血管外徑大于年輕組(t=3.04～5.16,P<0.05)。見圖1F。血管內(nèi)徑變化百分比組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組別=39.50，P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F灌注壓=158.20，P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=29.91，P<0.05)；單獨效應(yīng)分析結(jié)果顯示，灌注壓在2.7～8.0 kPa時，老年組血管內(nèi)徑增加百分比小于年輕組(t=2.93～9.99,P<0.05)。見圖1G。

2.2 腦小動脈結(jié)構(gòu)參數(shù)隨灌注壓升高的變化

血管壁厚度組間比較差異有顯著意義(F組別=7.04，P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F灌注壓=9.79，P<0.05)，二者不存在交互作用(F交互=2.00，P>0.05)；單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在5.3～8.0 kPa時，老年組的血管壁厚度大于年輕組(t=2.78～2.90,P<0.05)。見圖2A。血管壁橫截面積組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組別=25.86，P<0.05),不同灌注壓相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F灌注壓=6.72，P<0.05)，二者不存在交互作用(F交互=0.75，P>0.05)；單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在0.7～8.0 kPa時，老年組的管壁橫截面積大于年輕組(t=4.73～5.22,P<0.05)。見圖2B。血管壁厚度與管徑之比組間比較差異有顯著意義(F組別=7.23，P<0.05),不同灌注壓情況下比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F灌注壓=43.99，P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=3.742，P<0.05)；單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在5.3～8.0 kPa時，老年組管壁厚度與管徑之比大于年輕組(t=2.88～3.23,P<0.05)。見圖2C。

管壁應(yīng)變組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組別=40.02，P<0.05),不同灌注壓比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F灌注壓=156.10，P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=29.54，P<0.05)；單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓在2.7～8.0 kPa時，老年組管壁應(yīng)變小于年輕組(t=2.96～9.95,P<0.05)。見圖2D。管壁應(yīng)力組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組別=7.05，P<0.05),不同灌注壓比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F灌注壓=230.10，P<0.05)，二者存在交互作用(F交互=10.60，P<0.05)；單獨效應(yīng)結(jié)果顯示，灌注壓為6.7、8.0 kPa時，老年組管壁應(yīng)力值均小于年輕組(t=4.45、5.34,P<0.05)。見圖2E。應(yīng)力-應(yīng)變曲線擬合模型：年輕組σ=1.31e5.44ε，老年組σ=1.05e9.95ε；曲線的擬合優(yōu)度:年輕組R2=0.97，老年組R2=0.98；年輕組β=5.44±1.30，老年組β=9.95±1.31，老年組的β值大于年輕組(t=10.34,P<0.05)。見圖2F。

3 討 論

已有研究顯示，衰老會導(dǎo)致腦小動脈的肌源性反應(yīng)一定程度的受損，肌源性反應(yīng)是維持腦血流自調(diào)節(jié)的重要機制[17-18]。衰老后，腦小血管肌源性反應(yīng)受損，可以導(dǎo)致腦血流自調(diào)節(jié)失常，繼而造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、神經(jīng)損害、血-腦脊液屏障破壞、炎性滲出等，并最終導(dǎo)致腦血管疾病、認(rèn)知障礙和癡呆等[18-22]。衰老情況下，腦血管疾病發(fā)病率增高。動脈重塑主要表現(xiàn)為動脈直徑、管壁結(jié)構(gòu)、擴張性能以及硬化程度的變化。動脈重塑是動脈功能減退的主要標(biāo)志[23]。本研究通過檢測在無鈣條件下血管被動擴張狀態(tài)的血管內(nèi)徑、管壁厚度、橫截面積等以反映血管的重塑情況。在無鈣條件下，隨著灌注壓的升高，血管因為缺乏鈣而無法主動收縮，只能隨著灌注壓的升高而被動擴張。因此，在無鈣的情況下測量血管的各項指標(biāo)可以反映血管的被動舒張性能。本文結(jié)果顯示，衰老情況下，血管內(nèi)徑增大，管壁變厚，橫截面積增加，管壁厚度與管徑之比增大，擴張性能減弱，提示衰老會導(dǎo)致血管重塑、彈性變差，尤其是在血壓增高的情況下，更易發(fā)生腦血管意外。另外，衰老不是只影響腦的小動脈，很可能其他各器官小動脈都會受累，而小動脈系統(tǒng)具有容量血管和調(diào)節(jié)血流量的作用，當(dāng)小動脈擴張性能減弱、彈性變差時，其容量血管和調(diào)節(jié)血流量的作用勢必受影響，這在一定程度上可能會影響外周阻力，從而促進(jìn)高血壓的發(fā)生，但需要進(jìn)一步的實驗去證實。

本文研究中腦小動脈的灌注壓范圍為1.3～8.0 kPa。已有多項研究證實，動脈灌注壓會隨著血管直徑的縮小而逐漸減小，腦表面動脈(直徑100～200 μm)的灌注壓大約為大動脈的50%以下[24]，即腦表面動脈的灌注壓為5.3～8.0 kPa，而腦小動脈的管徑則遠(yuǎn)小于腦表面動脈，因此其正常灌注壓比5.3～8.0 kPa更小。已有研究顯示，衰老會導(dǎo)致小鼠腦小動脈的重塑[16]，但其使用的灌注壓為5.3～16.0 kPa，這遠(yuǎn)超腦小動脈的正常灌注壓，并且也未比較收縮功能的差異，因此并不能真實反映腦小動脈的重塑情況以及自調(diào)節(jié)的改變。

另外，本文還引入了應(yīng)力-應(yīng)變曲線來描述血管的彈性性能和硬化程度。應(yīng)力-應(yīng)變曲線又稱為彈性模量，是衡量材料產(chǎn)生彈性形變難易程度的指標(biāo)，其值越大，材料剛度越大，在一定應(yīng)力下發(fā)生彈性形變的能力越小。本文結(jié)果顯示，對年輕組和老年組的應(yīng)力和應(yīng)變進(jìn)行擬合后，計算得到老年組β值明顯大于年輕組，說明老年組的彈性模量明顯大于年輕組，因此老年組的腦小動脈具有更差的彈性性能和更高的硬化程度和剛度。進(jìn)一步證實衰老會導(dǎo)致腦小動脈結(jié)構(gòu)的改變。

綜上所述，衰老不僅會影響腦小動脈的收縮功能，從而影響腦實質(zhì)局部血流量的調(diào)節(jié)，同時也在血管重塑和硬化中起著重要作用。腦小動脈的這些結(jié)構(gòu)和功能的改變在腦小血管疾病的發(fā)病機制中具有重要意義。但是本實驗僅局限于體外實驗，腦血流的自調(diào)節(jié)不僅是動脈血管肌源性反應(yīng)的結(jié)果，還受神經(jīng)、體液等多種因素的影響，因此衰老對腦血流自調(diào)節(jié)的影響還需體內(nèi)實驗加以驗證。