呂浩宇 田迎迎

摘要：樣品經(jīng)過提取，經(jīng)色譜柱分離，流動(dòng)相梯度洗脫，多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測?？疾旆Q量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、測量重復(fù)性等主要因素引入的不確定度，并對不確定度的各分量進(jìn)行計(jì)算和合成。實(shí)驗(yàn)過程中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的不確定度為0.31μg/kg。

關(guān)鍵詞：不確定度;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇;大米;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

緒論

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是一種真菌毒素，主要由禾谷鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、尖孢鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生[1]。該毒素具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性和胚胎毒性，也具有一定的致畸致癌性，對免疫系統(tǒng)也有影響，人或畜食用被該毒素污染的糧食或飼料后可能對其健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害。因此中GB2761-2019中增加了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測限量標(biāo)準(zhǔn)[2，3]。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，蒸煮及食物加工都不能破壞其毒性，近年來的跟蹤監(jiān)測檢出率較高，危害性不容忽視。檢測方法主要是（GC-MS）、（HPLC）和（HPLC-MS），HPLC法干擾較多，定性能力不強(qiáng)，GC-MS前處理需要衍生，相較而言，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）具有更高分離和抗干擾能力，優(yōu)勢明顯，應(yīng)用最為廣泛。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測[3]，檢測過程中受實(shí)驗(yàn)環(huán)境、儀器設(shè)備、人員操作等因素的影響，測量會(huì)不可避免的引入一定的不確定度[4]。不確定度是利用可獲得的信息，表征賦予被測量量值分散性的非負(fù)參數(shù)[5]，其數(shù)值大小反映了測量結(jié)果質(zhì)量的高低，可用于評(píng)價(jià)定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，為不同測試機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)互認(rèn)提供參考，因此評(píng)定測量不確定度對于保證測量結(jié)果的準(zhǔn)確性非常重要[6～8]。本研究參考JJF10591.1-2012《測量不確定度評(píng)定與表示》、CNAS-GL006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[9]和GB/T27418-2017《測量不確定度評(píng)定和表示》[5]等對液質(zhì)聯(lián)用檢測大米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的不確定度進(jìn)行分析，以期為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的準(zhǔn)確檢測提供參考。

一、測試方法簡述

1、提取及凈化

稱取樣品2g（精確至0.001g），用乙腈水溶液提取，渦旋，超聲，離心，取上清液凈化，凈化液用氮?dú)獯蹈?，乙?乙酸銨定容1.00mL，過膜，待液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。采用樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)評(píng)定方法的不確定度。分別吸取樣液進(jìn)樣，測得其峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)系列的一元線性回歸方程中求得樣液中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量。

2、儀器條件

（1）液相色譜條件：

色譜柱：ZORBAXEclipsePlusC183.0*100mm，1.8μm;

流速：0.4mL/min;進(jìn)樣量：10.0μL;柱溫：40℃;

液相色譜梯度洗脫程序見表2-1。

（2）質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧離子源，負(fù)離子模式ESI-;MRM

毛細(xì)管電壓：3.0kV;噴嘴電壓：0.5kV;離子源溫度：100℃;脫溶劑氣及鞘氣：N2;脫溶劑氣溫度：350℃;脫溶劑氣流量：360L/h;脫溶劑氣壓力：40psi;碰撞氣：高純N2;

保留時(shí)間、監(jiān)測離子對、去簇電壓及碰撞能量見表2-2。

3、計(jì)算公式

試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量按下式進(jìn)行計(jì)算

二、不確定度的來源分析及測量數(shù)學(xué)模型的建立

從測量過程和數(shù)學(xué)模型分析，樣品測定的不確定度來源有：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度urel（C）;標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)引入的不確定度urel（X0）;樣品稱量引入的不確定度urel（m）;樣品溶液添加、稀釋和定容引入的不確定度urel（V）;結(jié)果重復(fù)性引入的不確定度urel（frep）。

不確定度數(shù)學(xué)模型：

三、不確定度評(píng)定

1、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇內(nèi)標(biāo)溶液的配制，因此標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇濃度為200.3±6.2μg/mL、13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇內(nèi)標(biāo)溶液濃度為25.0±0.2μg/mL，按正態(tài)分布置信概率P=95%，包含因子k=2，

（2）外標(biāo)溶液配制、稀釋引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)品配制所使用的10mLA級(jí)容量瓶20℃時(shí)的容量允差為±0.020mL，服從三角分布，區(qū)間半寬度a（V10）=0.020ml*k=，由此引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1（V10）=a（V10）/k=0.020/=0.00817，實(shí)驗(yàn)室溫度在（20±5）℃之間變動(dòng)，甲醇的膨脹系數(shù)（20℃）為0.000118/℃，對10ml容量瓶由溫度效應(yīng)產(chǎn)生的體積變化為10*5*0.000118=0.059ml，服從均勻分布，k=，由此引起的不確定度u2（V10）=a/k=0.59/=0.0341mL，故u（V10）==0.0351，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V1）=u（V10）/V10=0.00351。

標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引入的不確定度：標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋使用200μl移液槍，其容量允差為±2.0μl，服從均勻分布，k=，由此引起的不確定度u1（V200）=a1（V200）/k=2.0/=1.15μL;由溫度效應(yīng)產(chǎn)生的體積變化分別為200*5*0.00115=1.18μl，服從均勻分布，k=，u2（V200）=1.18/=0.682μl，故稀釋過程中移液槍使用引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（V200）==1.34μL，稀釋過程中用到10mLl容量瓶1次，移液槍50μL（DON）一次，故標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由此，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、稀釋過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜上所述，外標(biāo)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相關(guān)結(jié)果見表3-1。

（3）內(nèi)標(biāo)物引入的不確定度

內(nèi)標(biāo)物濃度引入的不確定度：內(nèi)標(biāo)溶液配制、稀釋、添加引入的不確定度計(jì)算與外標(biāo)的計(jì)算方法相同，其值為urel（V1）=u（V10）/V10=0.00351;實(shí)驗(yàn)過程中內(nèi)標(biāo)溶液的添加是用200μL移液槍（2次），故內(nèi)標(biāo)溶液稀釋引入的不確定為urel（V2）==0.010，實(shí)驗(yàn)過程中，內(nèi)標(biāo)溶液的添加使用200μl移液槍，移液槍引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（V200）=1.35μL，樣品前處理過程中內(nèi)標(biāo)溶液移取體積為20μL，故內(nèi)標(biāo)溶液添加引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（V3）=1.35/20=0.0675。由此內(nèi)標(biāo)配制、稀釋、添加過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（V）===0.0683，故13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇內(nèi)標(biāo)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（Cistd）==0.0684。

2、最小二乘法擬合引入的不確定度

試驗(yàn)中，配制6個(gè)濃度的校準(zhǔn)溶液：1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，20.0ng/mL，50.0ng/mL（其中含內(nèi)標(biāo)物13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇濃度均為10.0ng/mL），外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比X0分別為0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液測定一次，得到內(nèi)外標(biāo)峰面積比值y，對以上測定數(shù)據(jù)采用最小二乘法進(jìn)行擬合，得到校準(zhǔn)曲線方程y=ax+b和擬合系數(shù)r2，相關(guān)結(jié)果見表3-2。

為了評(píng)定最小二乘法估計(jì)量的不確定度，首先必須對直接測量所得的測量數(shù)據(jù)進(jìn)行不確定度評(píng)估，實(shí)際上就是求出測量數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差：

公式中為當(dāng)輸入量為xj時(shí)，儀器響應(yīng)值與擬合直線上對應(yīng)的相應(yīng)值之差。

在用間接式測量儀器測量時(shí)，利用校準(zhǔn)曲線，在測量樣品響應(yīng)值y0后，可以按照線性回歸方程計(jì)算被測量的預(yù)估值x0，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（x0）為：

公式中s（y）為校準(zhǔn)溶液峰面積比殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差，b為擬合直線的斜率，p為樣品平行測量的次數(shù)（p=6），n為擬合直線的數(shù)據(jù)總數(shù)（n=6），x0為樣品平行測量p次結(jié)果的平均值，為繪制擬合直線全部輸入值xi的總平局值，urel（x0）=u（x0）/x0，計(jì)算結(jié)果見表3-5。

3、樣品稱樣量引入的不確定度

樣品稱樣量使用萬分之一天平準(zhǔn)確稱取，天平最大允許誤差為±0.1mg，按均勻分布考慮，包含因子k=，不確定度為urel（m）=0.0001/=0.000003。

樣品溶液添加、稀釋和樣品定容引入的不確定度：

樣品溶液添加引入：實(shí)驗(yàn)過程中提取液的添加使用10ml移液器，根據(jù)JJG646-2006的規(guī)定，容量允差為±0.6%，服從均勻分布，k=，u1（V10）=10000a（V10）/k=0.00346ml，由溫度效應(yīng)產(chǎn)生的體積變化為10*5*0.00137=0.0685ml，服從均勻分布u2（V10）=0.0395ml，即urel（V1）=/10=0.00397。

樣品溶液稀釋引入的不確定度：實(shí)驗(yàn)過程中，氮吹濃縮5ml樣品溶液使用10ml移液器，容量允差為±0.6%，服從均勻分布，k=，u1（V10）=5000a（V10）/k=0.00173ml，由溫度效應(yīng)產(chǎn)生的體積變化為5*5*0.00137=0.0342ml，服從均勻分布u2（V10）=0.0197ml，即urel（V2）=/5=0.00685。

定容體積引入的不確定度：樣品定容使用1ml移液器，容量允許差為±1.0%，服從均勻分布，u1（V1000）=1000*1.0%/=5.774μl，實(shí)驗(yàn)室溫度引起的體積變化可以忽略不計(jì)，故urel（V3）=5.774/1000=0.00577。

綜上所述，樣品溶液添加、稀釋和定容引入的不確定度為urel（V）==0.00980。

結(jié)果重復(fù)性引入的不確定度：在重復(fù)性條件下對4ng進(jìn)行了6次獨(dú)立測試，平行測試結(jié)果和平均值見表3-6，根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算的單次測量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：u（X）=s（X）=（3-8）

以多次測量結(jié)果的算術(shù)平均值為最佳估算值，則測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u（）=s（）/（3-9）

由此結(jié)果重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

結(jié)果見下表。

4、樣品合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品中目標(biāo)化合物的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（x）=x*urel，取包含因子k=2，置信概率p=95%，則擴(kuò)展不確定度為U（x）=k*u（x）。

四?結(jié)論

本文采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對大米中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進(jìn)行測定，比較各分量不確定度的大小發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過程中標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制帶來的不確定度影響最大。該方法準(zhǔn)確可靠，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的不確定度分別為0.31μg/kg，為檢測過程中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性提高提供技術(shù)指導(dǎo)。

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