尚昱志 李陳玲 韋露秋 方剛

摘 要：目的：應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略對大棗補血機制進行分析、探討。方法：通過文獻和TCMSP平臺獲取大棗的成分，根據(jù)成分的含量、口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）、類藥性（Drug Likeness，DL）綜合篩選出大棗潛在有效成分，通過DisGeNET和BATMAN-TCM平臺獲取大棗補血的潛在靶點并進行富集分析，應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“大棗-有效成分—補血靶點—核心通路”網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果：以可視化圖表的形式較直觀地展現(xiàn)及分析了大棗的荷葉堿、原卟啉、環(huán)磷酸腺苷等15個有效成分通過影響IL6、TNF、IGF1等52個補血靶點進而調(diào)控造血細胞系通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路的潛在核心補血機制。結(jié)論：本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測及分析了大棗多成分、多靶點、多通路調(diào)控的補血機制，為進一步開展大棗補血機制研究及大棗相關(guān)藥物、保健食品的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大棗;補血;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);貧血;分子機制

大棗是中醫(yī)、壯醫(yī)藥膳調(diào)理血虛的常用食材之一?，F(xiàn)代研究表明，大棗營養(yǎng)成分豐富，具有抗氧化、促進骨髓造血等作用，但其補血機制尚未明確[1-3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在組學(xué)和大數(shù)據(jù)高速發(fā)展的基礎(chǔ)上，融合了系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)等的對生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)進行整體分析的一門學(xué)科[4]。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略已成為闡釋中藥有效性和科學(xué)性的新策略[5]。中醫(yī)血虛證與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的貧血臨床表現(xiàn)、病因、治療目的均有著較高相似性，二者均為體內(nèi)血液虧虛，出現(xiàn)皮膚、唇、舌、指甲色淡無華等臨床表現(xiàn);二者病因大致相似，血虛證之血液生化不足類似于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)紅細胞生成減少，血液耗損過多類似于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的急慢性失血;二者均以補血為治療目的[6]。本研究嘗試將貧血的疾病靶點作為血虛證的靶點，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略構(gòu)建“大棗-有效成分—補血靶點—核心通路”多層次網(wǎng)絡(luò)，對大棗的潛在補血機制進行預(yù)測及探討。

1 資料與方法

1.1 大棗潛在有效成分及靶點的獲取

TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/index.php）是一個融合了藥物化學(xué)、藥代動力學(xué)等信息的中藥研究分析平臺[7]，通過檢索TCMSP以獲取大棗成分來源?？诜锢枚龋∣ral Bioavailability，OB）、類藥性（Drug Likeness，DL）是藥物活性成分篩選的主要指標[8-9]，故以“OB≥30%、DL≥0.18”為條件篩選大棗的活性成分，將篩選出的活性成分和含量較高的成分作為大棗潛在有效成分[7]。

DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）是一個整合了包括CTD、UniProt、HPO等數(shù)據(jù)庫資源的人類疾病相關(guān)基因和變異信息數(shù)據(jù)的綜合平臺[10]，通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取貧血疾病基因靶點，亦視為血虛證相關(guān)靶點。BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中使用基于相似性的方法來預(yù)測中藥成分的潛在靶點[11]。通過BATMAN-TCM分別獲取大棗的潛在有效成分的潛在靶點，并以預(yù)測分值大于20的篩選條件獲取準確性較高的潛在靶點與血虛證相關(guān)靶點作交集以獲取二者的補血相關(guān)靶點。

1.2 富集分析

基因本體（Gene Ontology，GO）起源于1998年，已在生命科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，主要用于分析基因產(chǎn)物的生物學(xué)過程（Biological process，BP）、細胞組件（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）[12-13]。KEGG是一個整合了基因組、化學(xué)、疾病信息和系統(tǒng)功能綜合數(shù)據(jù)庫，通過KEGG通路對已完成測序的基因組進行生物學(xué)解釋，被廣泛用于分析基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等數(shù)據(jù)[14]。WebGestalt（http：//www.webgestalt.org）是一個廣泛使用、功能豐富的基因富集分析工具[15]。將大棗補血相關(guān)靶點導(dǎo)入WebGestalt進行GO和KEGG通路富集分析，使用在線繪圖工具Omishare Tool（http：//www.omicshare.com/tools）將富集結(jié)果可視化，并對富集KEGG通路進行分析，篩選出大棗補血的核心通路。

1.3 靶蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）及拓撲分析

將大棗補血相關(guān)靶點導(dǎo)入蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫STRING（https：//string-db.org/）[16]獲取靶點相互作用（PPI）關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，將PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1進行拓撲分析，參照張彥瓊等[17]提出的Hub節(jié)點篩選方法，以自由度、介數(shù)中心性和接近中性數(shù)值在平均值以上的靶點為Hub靶點。

1.4 核心機制網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將PPI網(wǎng)絡(luò)與大棗潛在有效成分、核心通路的相互關(guān)系共同導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1，構(gòu)建“大棗-有效成分-靶點-核心通路”的多層次核心機制網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大棗的潛在有效成分及血虛證相關(guān)靶點

從TCMSP中獲得大棗的化學(xué)成分133個，其中符合“OB≥30%，DL≥0.18”的成分29種，但其中未包含葡萄糖、果糖、環(huán)磷酸腺苷。大棗的含糖量高達30%～60%，在糖類中葡萄糖含量最高（32.5%），其次為果糖（30.8%）[18-19]。大棗的環(huán)磷酸腺苷含量約1.23～99.60 μg/g，位居水果首位[20]。故最終將葡萄糖、果糖、環(huán)磷酸腺苷及29種符合“OB≥30%，DL≥0.18”的成分共同作為大棗潛在有效成分進行進一步研究。

通過DisGeNET獲得血虛證相關(guān)靶點489個，通過BATMAN-TCM獲得預(yù)測分值大于20的大棗潛在有效成分靶點696個。通過貧血疾病靶點與大棗潛在有效成分靶點作交集得到大棗的潛在補血靶點52個，涉及大棗相應(yīng)的潛在有效成分15種，不同成分涉及的補血靶點數(shù)量不一，涉及補血靶點數(shù)量較多的成分可一定程度上認為該成分在大棗發(fā)揮補血功效起著較大作用。其中大棗潛在有效成分中荷葉堿、原卟啉、環(huán)磷酸腺苷、β-谷固醇、豆甾醇的補血靶點均在10個以上，其荷葉堿是一種阿樸啡類生物堿，有抗衰老、抗氧化、抑菌、調(diào)脂等作用[21]，原卟啉是血紅蛋白的重要組分之一[22]，環(huán)磷酸腺苷制劑在臨床應(yīng)用中可改善癌性貧血患者的貧血狀況[23]，β-谷甾醇和豆甾醇均屬于植物固醇，二者有抗炎、抗氧化、降低膽固醇等作用[24-25]（表1）。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將52個大棗的潛在補血靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫獲取PPI關(guān)系，進而將獲取的PPI關(guān)系應(yīng)用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。該網(wǎng)絡(luò)中含有52個節(jié)點和306條邊，除了ACAD8外的51個節(jié)點間均有著相互作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的自由度、介數(shù)中心性和接近中性的均值分別為11.77、0.02、0.53，篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中自由度、介數(shù)中心性和接近中性值均在均值以上的hub靶點12個：IL6、TNF、IGF1、NOS3、IL1B、EGFR、TLR4、HIF1A、HMOX1、CD34、SOD2、ABL1。

2.3 富集分析結(jié)果

2.3.1 GO分析 通過WebGestalt的GO分析可知，大棗補血相關(guān)的52靶點涉及代謝過程、生物調(diào)節(jié)、刺激反應(yīng)等12種BP和膜、膜封閉管腔、細胞外間隙等20種CC及蛋白結(jié)合、離子結(jié)合、核苷酸結(jié)合等15種MF（圖2）。

2.3.2 KEGG通路富集分 通過WebGestalt的KEGG通路分析獲得HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路等富集最顯著的10條通路（圖3）。

2.4 核心機制網(wǎng)絡(luò)分析

國內(nèi)外相關(guān)研究表明，在富集顯著程度排名前10的KEGG通路中有3條通路與貧血的發(fā)生機制密切相關(guān)，造血細胞系通路主要調(diào)控造血干細胞通過自我更新、復(fù)制、定向分化成不同的血細胞系并進一步生成血細胞[5]，HIF-1信號通路為紅細胞生成和鐵代謝的重要通路[26]，PI3K-Akt通路可通過抑制細胞凋亡、調(diào)控細胞周期進而促進紅細胞成熟[27-28]，其余7條顯著富集的KEGG通路與貧血的發(fā)生機制尚不明確，故可認為造血細胞系通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路為大棗補血的3條核心通路。該3條核心通路與大棗的13個有效成分和19個大棗潛在靶點直接相關(guān)，但大棗補血PPI網(wǎng)絡(luò)表明靶點間存在廣泛的相互作用關(guān)系，故可預(yù)測大棗的15個有效成分、52補血靶點與3條核心通路構(gòu)成的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)為潛在的大棗補血核心機制網(wǎng)絡(luò)（圖4）。

3 結(jié)論

本研究根據(jù)中醫(yī)血虛證與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的貧血相似性，運用貧血疾病分子機制來探討大棗的補血機制，為傳統(tǒng)藥物、食材功效或保健功能的機制研究提供研究思路。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法以可視化網(wǎng)絡(luò)圖的方式直觀展顯了包含了荷葉堿、原卟啉、環(huán)磷酸腺苷等15個有效成分和IL6、TNF、IGF1等52個補血靶點及造血細胞系通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路的多成分、多靶點、多通路調(diào)控的潛在大棗補血核心機制網(wǎng)絡(luò)，為進一步開展大棗補血機制研究及大棗相關(guān)藥物、保健食品的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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Study on the Enriching Blood Mechanism of Jujube Based on Network Pharmacology

SHANG Yu-zhi1，2，LI Chen-ling1，WEI Lu-qiu1，F(xiàn)ANG Gang1，2

（1Guangxi Zhuang Yao Medicine Center of Engineering and Technology，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China;2Guangxi Zhuang Yao Medicine Center of Engineering and Technology，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China）

Abstract：【Objective】 To analyze and discuss the enriching blood mechanism of Jujube applied research strategies of network pharmacology.【Method】 To obtain the compositions of the Jujube by documents and TCMSP platform，according composition content，oral bioavailability（OB），and drug likeness（DL）to comprehensive screening potential active ingredients of Jujube.And then to get potential targets to enriching blood of Jujube and make enrichment analysis by DisGeNET and BATMAN-TCM platform，and Cytoscape3.7.0 was applied to construct“Jujube-active ingredient-enriching blood targets-hub pathways”network.【Result】 It can present visually and analyze potential core enriching blood mechanism of Jujube whose 15 active ingredients of nuciferine，protoporphyrin IX and cyclic adenosine monophosphate and so on can effect 52 enriching blood targets of IL6，TNF，IGF1 and so on to regulate and control the hematopoietic cell line pathway，HIF-1 signaling pathway and PI3K-Akt signaling pathway by the form of Visual chart.【Conclusion】 This study successfully to predict and analyze enriching blood mechanism of Jujube in multi-component，multiple target point and multichannel regulation by network pharmacology，and it provides the scientific basis for the further research of enriching blood mechanism of Jujube and related drug and health food development in Jujube.

Keywords：jujube;enriching blood;network pharmacology;anemia;molecule mechanism

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（項目編號：81660830）;中醫(yī)藥廣西一流學(xué)科建設(shè)項目（項目編號：桂教科研[2018]12）;廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西一流學(xué)科建設(shè)開放課題（項目編號：2019XK038）。

作者簡介：尚昱志（1993— ），男，碩士研究生，研究方向：壯醫(yī)藥基礎(chǔ)與臨床。

通信作者：方 剛（1980— ），男，博士，教授，研究方向：民族醫(yī)、中藥民族藥。