李可維 張宏超 劉海晶 孫莉 張雪

摘要：根據(jù)發(fā)酵原料藥生產(chǎn)要求，對(duì)維生素C生產(chǎn)所用的發(fā)酵罐進(jìn)行滅菌工藝驗(yàn)證，通過熱分布測(cè)試確認(rèn)發(fā)酵罐的溫度分布，通過微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)發(fā)酵罐的無菌狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵罐 熱分布測(cè)試 微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)

1 引言：

在維生素C發(fā)酵生產(chǎn)前需要保持確保空發(fā)酵罐的無菌狀態(tài)，依據(jù)制藥行業(yè)規(guī)范和GMP對(duì)發(fā)酵罐空消滅菌過程實(shí)施熱分布測(cè)試和微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)。從而實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的無菌純培養(yǎng)，降低發(fā)酵液染菌的風(fēng)險(xiǎn)，保證產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效益。

2 GMP發(fā)酵罐的主要技術(shù)參數(shù)

（1）發(fā)酵罐工作體積為200m3。

（2）發(fā)酵罐由罐體，管路和控制系統(tǒng)組成。

（3）能夠準(zhǔn)確控制攪拌速度、空氣流量和培養(yǎng)溫度，能夠精確測(cè)量溫度、pH值和空氣流量。

（4）發(fā)酵罐為上攪拌發(fā)酵罐，采用雙端面機(jī)械密封，具有良好的密封性能。

（5）無菌空氣采用雙級(jí)過濾器進(jìn)行除菌過濾，過濾效率高，能夠耐受蒸汽滅菌。

（6）罐體和管路均采用304不銹鋼制作，接觸液體表面經(jīng)過拋光處理，罐體具有零死角接種閥、取樣閥和底閥。

3 實(shí)驗(yàn)儀器、耗材

3.1 WL-T1無線溫度驗(yàn)證系統(tǒng)

型號(hào) WL-T1通用型

感溫元件 PT1000

測(cè)量范圍 -60℃至150℃

精度 ±0.1℃

分辨率 0.01℃

記錄儀材質(zhì) 316L不銹鋼

3.2生物指示劑

生產(chǎn)商：美國(guó)3M公司 型號(hào)：Attest 1262-S生物指示劑（蒸汽）

D值（121℃）：1.5～3.0分鐘 菌種：ATCC7953嗜熱脂肪地芽孢桿菌

培養(yǎng)溫度：56℃±2℃ 孢子量：1.0×106～9.9×106

Z值：≥6℃ 儲(chǔ)存條件：15～30℃，35%～65%RH

3.3可擴(kuò)展試驗(yàn)箱

設(shè)備型號(hào)：BXS-250 設(shè)備容積：250L

電源電壓：220V/50Hz 控溫范圍：0～70℃

出廠日期：2019年08月20日 出廠編號(hào)：190020

生產(chǎn)商：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠

3.4 高精度數(shù)字溫度計(jì)

設(shè)備型號(hào)：IPRT-1 出廠編號(hào)：19071829

量程：-200℃～500℃ 校驗(yàn)周期：1年

校驗(yàn)日期：2020年08月26日 下次校驗(yàn)：2021年08月25日

生產(chǎn)商：深圳市研工科技有限公司

3.5 恒溫油槽

設(shè)備型號(hào)：CJTH-300A 設(shè)備出廠編號(hào)：8687

工作溫度范圍：90℃～300℃ 溫度波動(dòng)度：±0.01℃

溫度均勻度：±0.01℃ 生產(chǎn)廠家：湖北唯立儀表廠

4驗(yàn)證方案設(shè)計(jì)

4.1無線溫度驗(yàn)證系統(tǒng)前校準(zhǔn)

開機(jī)前檢查油槽內(nèi)硅油液位是否在加熱管之上，檢查無誤連接電源。判斷標(biāo)準(zhǔn)處判定時(shí)間設(shè)置3分鐘，偏差要求值設(shè)置0.5℃。校準(zhǔn)低點(diǎn)設(shè)置為110℃，高點(diǎn)設(shè)置為140℃，校驗(yàn)點(diǎn)設(shè)置為125℃。設(shè)置后將無線記錄器和標(biāo)準(zhǔn)溫度計(jì)放置在恒溫油槽內(nèi)。停止倒計(jì)時(shí)后，取出無線記錄器充分冷卻后擦干無線記錄器表面的水分，上傳無線記錄器的數(shù)據(jù)。完成校準(zhǔn)過程。

校準(zhǔn)結(jié)束后查看原始校準(zhǔn)數(shù)據(jù)，查看溫度波動(dòng)、補(bǔ)償值、偏差值是否有異常情況，在溫度校準(zhǔn)報(bào)告的最后一頁查看校準(zhǔn)是否通過。

4.2空消熱分布測(cè)試

（1）熱分布測(cè)試策略：

發(fā)酵罐是維生素C發(fā)酵設(shè)備，為確保持續(xù)穩(wěn)定的微生物發(fā)酵需要，采用空消滅菌工藝，需進(jìn)行熱分布測(cè)試。發(fā)酵罐在日常滅菌過程中，使用空消滅菌程序，在進(jìn)行發(fā)酵罐驗(yàn)證時(shí)將開展對(duì)應(yīng)的滅菌程序測(cè)試和生物挑戰(zhàn)?；谏a(chǎn)工藝流程，發(fā)酵罐的空消滅菌工藝條件為（125℃/70min）。本次為該滅菌程序在該設(shè)備上的首次驗(yàn)證，因此驗(yàn)證方案設(shè)計(jì)為連續(xù)測(cè)試3次。

（2）熱分布測(cè)試風(fēng)險(xiǎn)分析

空消滅菌工藝本身的風(fēng)險(xiǎn);溫度不能達(dá)到滅菌條件要求;溫度不均一（可能由于進(jìn)汽程序、排汽/氣程序、設(shè)備結(jié)構(gòu)造成的局部冷點(diǎn)）;滅菌時(shí)間不夠;空氣熱傳導(dǎo)和金屬熱傳導(dǎo)速度的差異造成滅菌時(shí)間的差異;

（3）熱分布布點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)控制策略：

根據(jù)滅菌對(duì)象的空間幾何形狀進(jìn)行布點(diǎn)，以識(shí)別空間幾何形狀對(duì)溫度分布的影響;根據(jù)罐體內(nèi)滅菌對(duì)象進(jìn)行布點(diǎn)，以識(shí)別滅菌對(duì)象性質(zhì)差異造成對(duì)溫度分布的影響;根據(jù)進(jìn)汽點(diǎn)位置進(jìn)行布點(diǎn)，以評(píng)估進(jìn)汽點(diǎn)溫度（可能的高溫點(diǎn)）可能對(duì)滅菌效果影響;根據(jù)排汽點(diǎn)（疏水）進(jìn)行布點(diǎn)，以評(píng)估排汽點(diǎn)溫度（可能的低溫點(diǎn)）可能對(duì)滅菌效果的影響;

布置15根溫度探頭，其中1#至12#探頭分別固定在發(fā)酵罐的上中下3層，按照罐體高度平均分為上中下三層，每層4個(gè)點(diǎn)，周邊每120度一個(gè)，1#、5#、9#為各層的中心點(diǎn);

13#置于上封頭頂部空間中心位置;

14#置于罐底排放管道位置;

15#至放置在發(fā)酵罐溫度控制探頭處，

根據(jù)內(nèi)壁部件選擇發(fā)酵罐的適當(dāng)位置進(jìn)行固定（盤管、擋板、攪拌器轉(zhuǎn)軸），如無適當(dāng)依托則制作相應(yīng)的內(nèi)部托架;

（4）熱分布測(cè)試接受標(biāo)準(zhǔn)

在滅菌階段各點(diǎn)的累積F0值要求≥15為合格;

在滅菌階段，所有傳感器的溫度值均達(dá)到125℃;保壓時(shí)間達(dá)到70min。

（5）熱分布測(cè)試接受導(dǎo)出測(cè)試結(jié)果后，參照前校準(zhǔn)對(duì)無線溫度驗(yàn)證系統(tǒng)實(shí)施后校準(zhǔn)。

4.3生物挑戰(zhàn)測(cè)試

（1）生物指示劑確認(rèn)：選用嗜熱脂肪地芽孢桿菌ATCC7953;孢子量符合1.0×106～9.9×106cfu/條的標(biāo)準(zhǔn)

（2）生物指示劑放置要求：生物指示劑和無線溫度探頭同時(shí)進(jìn)行布點(diǎn)。

（3）生物指示劑使用方法：

按照布點(diǎn)圖分別將生物指示劑放在發(fā)酵罐內(nèi)不同位置，啟動(dòng)滅菌程序進(jìn)行滅菌。滅菌完畢，取出該生物指示劑。擠破內(nèi)含的安瓿，與一支陽性對(duì)照管一起放于56℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48小時(shí)后觀察培養(yǎng)結(jié)果。

（4）生物挑戰(zhàn)測(cè)試可接受標(biāo)準(zhǔn)

陽性對(duì)照：培養(yǎng)后陽性對(duì)照指示管應(yīng)有微生物生長(zhǎng)，即培養(yǎng)基顏色呈黃色，則該次試驗(yàn)有效。培養(yǎng)后陽性對(duì)照指示管標(biāo)簽仍呈現(xiàn)粉紅色。

蒸汽滅菌后的生物指示劑：培養(yǎng)后經(jīng)滅菌的所有生物指示劑保持紫色為無菌生長(zhǎng)，判定為滅菌合格。培養(yǎng)后經(jīng)滅菌的所有生物指示劑標(biāo)簽從粉紅色變成棕色。

5 驗(yàn)證結(jié)果分析

（1）無線溫度驗(yàn)證系統(tǒng)校準(zhǔn)結(jié)果分析

前校準(zhǔn)及后校準(zhǔn)均一次性通過，在校準(zhǔn)溫度點(diǎn)無線探頭和標(biāo)準(zhǔn)溫度計(jì)的最大偏差為0.02℃，遠(yuǎn)小于0.5℃的偏差要求，說明無線溫度驗(yàn)證系統(tǒng)和恒溫油槽的穩(wěn)定性較高，其穩(wěn)定性和國(guó)外同類產(chǎn)品一致。

（2）熱分布結(jié)果分析

對(duì)三次熱分布測(cè)試的滅菌保持階段的最低溫度、滅菌保持階段的時(shí)間和累積的F0值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2：熱分布測(cè)試關(guān)鍵數(shù)據(jù)匯總表

三次熱分布測(cè)試的滅菌段最低溫度均大于設(shè)定的滅菌可接受標(biāo)準(zhǔn)中的125℃，且三次熱分布測(cè)試滅菌段最低溫度極差為1.41℃。三次熱分布測(cè)試滅菌段最高溫度極差為0.63℃。三次熱分布測(cè)試的滅菌階段時(shí)間均為70min。最小累積F0值遠(yuǎn)大于可接受標(biāo)準(zhǔn)15，且三次熱分布測(cè)試最小累積F0值極差為20.22。說明滅菌程序熱分布測(cè)試達(dá)到了預(yù)定目標(biāo)，滅菌程序的重復(fù)性較好。

（3）微生物挑戰(zhàn)結(jié)果分析

所使用的生物指示劑信息：

生產(chǎn)商：3M 型號(hào)：1262-S 生產(chǎn)批號(hào)：333K3W

菌種：ATCC7953 孢子量：4.6×106CFU D值（121℃）：2.1min

存活時(shí)間：9.79min 殺滅時(shí)間：22.39min Z值：15℃

生產(chǎn)日期：2020年10月29日 有效期：2022年10月28日

每次滅菌測(cè)試結(jié)束后，罐體完成降溫后將生物指示劑與無線記錄儀一起取出，將指示劑中的培養(yǎng)基玻璃小瓶捏碎后，將生物指示劑放在生化培養(yǎng)箱中，在56℃的條件下培養(yǎng)48小時(shí)候觀察培養(yǎng)結(jié)果，三次滅菌的生物指示劑全部符合滅菌要求（呈深藍(lán)色），陽性呈現(xiàn)黃色，達(dá)到了滅菌驗(yàn)證方案中的預(yù)定要求。

參照美國(guó)注射劑協(xié)會(huì)編寫的第61號(hào)技術(shù)報(bào)告《在線滅菌》中關(guān)于生物挑戰(zhàn)的分析，計(jì)算生物F0值如下：

FBIO=DT×SLR（孢子下降對(duì)數(shù)）

FBIO=DT×（logN0-logNF）

=2.1×（log4.6×106-log100）

=13.99

說明生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)已達(dá)到了過度殺滅（FBIO為12）的滅菌水平，滅菌條件能夠保證發(fā)酵罐的無菌條件下純培養(yǎng)要求。

6 結(jié)果討論

驗(yàn)證實(shí)施前進(jìn)行了多次的滅菌參數(shù)調(diào)試，以確保滅菌參數(shù)能夠符合滅菌工藝要求，在此強(qiáng)調(diào)良好的調(diào)試是滅菌驗(yàn)證的成功的保證，沒有一個(gè)萬能的參數(shù)能夠滿足不同要求，一定要結(jié)合自身的實(shí)際情況去摸索符合自身實(shí)際情況的控制參數(shù)，也是基于此點(diǎn)本文并未列出非常具體的滅菌參數(shù)。本文的最大價(jià)值為制藥行業(yè)同仁提供一個(gè)可供參考的案例進(jìn)行分享。

參考文獻(xiàn)

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[2]GBT 19972-2018醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌 生物指示劑選擇、使用和結(jié)果判斷指南

[3]USP42-NF37 <1229.1> Steam Sterilization by Direct Contact

[4]Parenteral Drug Association Technical Report No.61 Steam In Place

作者簡(jiǎn)介：李可維 1986.05.13 男 吉林省榆樹市 漢族 大學(xué)本科 助力工程師 從事藥品質(zhì)量管理