李明成，李亞晗，劉佳琳，蘭春陽(yáng)，孫曉紅，趙萬(wàn)濤，王立霞

(1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.吉林省中藥 DNA 指紋檢測(cè)技術(shù)科技創(chuàng)新中心，吉林 吉林 132013；3.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

靈芝(Ganodermalucidum)是我國(guó)傳統(tǒng)健康食藥用菌，《中國(guó)藥典》記載，靈芝有赤芝和紫芝，其具有極高的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值.市場(chǎng)上常見(jiàn)的有靈芝子實(shí)體和靈芝孢子粉.靈芝包含多種生物活性物質(zhì)，其中靈芝多糖(Ganodermalucidumpolysacc- haride，GLP)是靈芝的次生代謝產(chǎn)物，存在于靈芝的菌絲體和子實(shí)體中，具有降血脂、降血糖、抗腫瘤等功效[1-3].我國(guó)靈芝是以栽培為主，靈芝的菌種及地理環(huán)境對(duì)靈芝的營(yíng)養(yǎng)成分和GLP等活性物質(zhì)影響很大[4-6].尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase)已在植物的很多組織細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)儲(chǔ)存在胞液里，它是植物活化糖的主要存在形式，能夠催化反應(yīng)Glc-1-P+UTP轉(zhuǎn)化為UDPG+PPi，為纖維素、蔗糖以及果膠質(zhì)等的合成提供葡萄糖基[7].UGPase被認(rèn)為是調(diào)節(jié)靈芝多糖合成的關(guān)鍵限速酶，可能與靈芝多糖合成密切相關(guān)[8-9].

目前，市售的靈芝加工品多為切制加工過(guò)的靈芝片、靈芝孢子粉或靈芝孢子粉膠囊，還有少數(shù)口服液等保健品.由于靈芝被切成片或打成粉后很難鑒別真?zhèn)?，用?shù)舌或其他菌類(lèi)冒充靈芝加工品的情況時(shí)有發(fā)生.不同地源靈芝的生長(zhǎng)環(huán)境和加工過(guò)程不同，也導(dǎo)致了靈芝產(chǎn)品質(zhì)量千差萬(wàn)別[10].

本研究從生物分子學(xué)的角度出發(fā)，利用合成生物學(xué)的思路和方法，探究GLP的合成關(guān)鍵酶UGPase基因?qū)LP合成調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵元件特征，最終實(shí)現(xiàn)GLP活性天然產(chǎn)物代謝途徑的高效異源表達(dá)，從而解決不同地域種植差異、活性天然產(chǎn)物來(lái)源不足、不易實(shí)現(xiàn)化學(xué)合成等問(wèn)題[5].

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

靈芝孢子粉(批號(hào)：121701-201401，規(guī)格：0.5 g)及D-無(wú)水葡萄糖(批號(hào)：110833-201908，規(guī)格：0.5 g)為中國(guó)食品藥品檢定研究院提供標(biāo)準(zhǔn)品.篩選不同地源干燥靈芝孢子粉共7批18份，分別購(gòu)自云南、吉林、××堂(市售膠囊)，每份質(zhì)量100～250 g，由吉林市藥檢所金英蘭主任藥劑師鑒定真?zhèn)?

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品與供試品溶液的制備

精密稱(chēng)量無(wú)水葡萄糖對(duì)照品0.5 g，置于500 mL容量瓶中，加水溶解，定容至刻度線(xiàn)，最終配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的無(wú)水葡萄糖，為對(duì)照品貯存溶液.精密稱(chēng)量實(shí)驗(yàn)樣本靈芝孢子粉2 g，放入三角燒瓶中，加水50 mL，靜置30 min后沸水浴2 h，趁熱真空抽濾，用雙蒸水洗滌濾渣和濾器3次.將得到的洗滌液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋蒸20 min左右，將濾液濃縮到20 mL.取20 mL的濃縮液于離心管中，加入30 mL的無(wú)水乙醇，靜置過(guò)夜.然后10 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，于室溫晾干，沉淀用熱的雙蒸水溶解，洗滌離心3次，冷卻后，定容在500 mL容量瓶中，即可得供試品溶液.每份樣品重復(fù)3次.

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

精密量取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別放入帶塞子試管中，加雙蒸水至1.0 mL，再加入5%苯酚溶液1.0 mL搖勻，然后沿試管壁緩慢注入5 mL濃硫酸溶液，搖動(dòng)6 min，注意打開(kāi)蓋子釋放出氣體，室溫放置5 min后，于沸水浴中加熱10 min，取出并冷卻至室溫.使用1 cm的比色杯在490 nm處測(cè)得吸光度值，并將苯酚與硫酸作為溶劑用作空白對(duì)照.以無(wú)水葡萄糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、以吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).

1.2.3 供試品靈芝孢子粉多糖含量的測(cè)定

1.2.4 靈芝UGPase基因的克隆

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取靈芝UGPase基因(Seq- uence：KM260167.10)及內(nèi)參基因16SrRNA mRNA(AF493073.1)的序列基因，采用DNAStar等相關(guān)軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析及序列比較，選擇同源性較高的區(qū)域，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

表1 基因及引物序列Tab.1 Gene and primers’ sequences

孢子粉細(xì)胞總RNA及進(jìn)行cDNA合成：分別采用TaKaRa MinBEST Plant RNA Extraction Kit 和PrimeScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser(TaK- aRa，Japan)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)方法提取靈芝孢子粉細(xì)胞總RNA及進(jìn)行cDNA合成，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù).應(yīng)用1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性，應(yīng)用Q6000核酸蛋白分析儀測(cè)定260、280 nm波長(zhǎng)下總RNA濃度和純度.制備的cDNA儲(chǔ)存在-20 ℃的冰箱中.

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min.2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下進(jìn)行瓊脂糖凝膠中的目的條帶切取，選用pGM-T連接試劑盒，T-A連接、轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選與鑒定、重組質(zhì)粒提取參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行.將鑒定正確的克隆質(zhì)粒送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，結(jié)果應(yīng)用BioEdit 軟件比對(duì)，并登錄NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast分析.

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)UGPase-mRNA及繪制熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

將初始濃度為1 ng/μL的靈芝標(biāo)準(zhǔn)品cDNA設(shè)為模板，梯度稀釋至10-5ng/μL，每個(gè)稀釋度各取0.4 μL，熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行.使用Ct值作為縱坐標(biāo)，使用模板的對(duì)數(shù)濃度作為橫坐標(biāo)繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).線(xiàn)性關(guān)系用來(lái)衡量重復(fù)樣品數(shù)據(jù)和不同拷貝數(shù)的初始cDNA模板擴(kuò)增效率是否相同，R2值表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)滿(mǎn)足衰減的線(xiàn)性程度.每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行組，采用Excel軟件統(tǒng)計(jì)內(nèi)參基因與目的基因Ct值，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)mRNA水平.

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

通過(guò)紫外分光光度計(jì)法以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，得到回歸方程為Y=0.11X+0.11，R2=0.983 7.

2.2 靈芝孢子粉樣品GLP含量測(cè)定

精密吸取靈芝孢子粉供試品溶液1 mL，測(cè)其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到待測(cè)溶液中多糖的含量.經(jīng)計(jì)算，云南孢子粉多糖含量為(2.887 0±0.005 9)%，吉林孢子粉多糖含量為(3.361 0±0.004 6)%，××堂孢子粉多糖含量為(2.399 0±0.005 3)%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

2.3 UGPase基因克隆與鑒定

利用TIANSeq HiFi Amplification Mix高保真聚合酶克隆pUGPase-216 bp片段，目的基因均出現(xiàn)與目的條帶大小相符的清晰明亮條帶，說(shuō)明UGPase基因克隆成功(見(jiàn)圖2).克隆的質(zhì)粒被送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與生物信息學(xué)軟件BLAST工具和BioEdit進(jìn)行比較，結(jié)果表明：每個(gè)克隆片段的核苷酸序列與GeneBank中的注冊(cè)序列(Sequence：KM260167.1)相同，均為100% (見(jiàn)圖3)，證明克隆的DNA片段是目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)片段.克隆的片段存儲(chǔ)在-20 ℃下，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1Standard cure for glucose

M.100 bp Ladder marKer；1～2.不同來(lái)源靈芝孢子粉pUGPase-216 bp；3.標(biāo)準(zhǔn)品pUGPase-216 bp.圖2 PCR擴(kuò)增靈芝孢子粉UGPase基因質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳圖譜 Fig.2Agrose gell electrophoresis of UGPase gene inserted into the plasmid amplified by PCR

圖3 質(zhì)粒pUGPase-216 bp測(cè)序blast結(jié)果Fig.3Sequences and blast results of pUGPase-216 bp

2.4 UGPase基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線(xiàn)及熔解曲線(xiàn)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率計(jì)算目的基因UGPase和內(nèi)參基因16SrRNA的擴(kuò)增效率，分別為100.207%、100.109%，均接近100%，符合相對(duì)定量2-ΔΔCt法的計(jì)算要求.計(jì)算結(jié)果顯示：樣品反應(yīng)指數(shù)明顯擴(kuò)增，梯度樣品分布均勻，表明樣品重復(fù)性好、擴(kuò)增效率高、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確.熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖4.每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以靈芝孢子粉cDNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，得到目的基因UGPase和內(nèi)參基因16SrRNA的熔解曲線(xiàn)和擴(kuò)增曲線(xiàn).雖然不同地源靈芝孢子粉有差異，但條帶重復(fù)性及擴(kuò)增效率較好，說(shuō)明Ct值可信度高，可用于定量檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(見(jiàn)圖5).熔解曲線(xiàn)出現(xiàn)單峰，無(wú)非特異性擴(kuò)增和引物二聚體，表示擴(kuò)增產(chǎn)物單一，引物特異性高，結(jié)果可靠(見(jiàn)圖6).

圖4 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4Fluorescence quantitative PCR standard cure

A.孢子粉UGPase基因擴(kuò)增曲線(xiàn)；C.孢子粉內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線(xiàn).圖5 目的基因UGPase與內(nèi)參基因16SrRNA熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)Fig.5Fluorescence quantitative PCR amplification curve for UGPase and 16SrRNA

A.孢子粉UGPase基因熔解曲線(xiàn)；C.孢子粉內(nèi)參基因熔解曲線(xiàn).圖6 目的基因UGPase與內(nèi)參基因16SrRNA熒光定量PCR熔解曲線(xiàn)Fig.6Fluorescence quantitative PCR melting curve for UGPase and 16SrRNA

2.5 熒光定量PCR檢測(cè)UGPase-mRNA相對(duì)定量結(jié)果

選取堂孢子粉為對(duì)照，其他地源孢子粉作為實(shí)驗(yàn)組，計(jì)算其他地源孢子粉UGPase基因的相對(duì)表達(dá)量.本實(shí)驗(yàn)選用 2-ΔΔCt法以××堂孢子粉為對(duì)照組，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)公式：2-ΔΔCt=2-[(Ct(測(cè)試組目的基因)-Ct(測(cè)試組內(nèi)參基因))-(Ct(對(duì)照組目的基因)-Ct(對(duì)照組內(nèi)參基因))].不同地源靈芝孢子粉UGPase基因相對(duì)定量結(jié)果顯示，吉林產(chǎn)相對(duì)表達(dá)量含量為最高(見(jiàn)表2、圖7).

表2 不同地源靈芝孢子粉UGPase-mRNA相對(duì)表達(dá)含量Tab.2 Relative expression contents of UGPase-mRNA among G.lucidum spore powder from different land sources

***.P<0.005.圖7 不同地源靈芝孢子粉UGPase目的基因相對(duì)表達(dá)Fig.7Relative expression of UGPase-mRNA among G.lucidum spore powder from different land sources

3 討 論

GLP被認(rèn)為是靈芝主要生物活性成分，《中國(guó)藥典》中記錄GLP含量是評(píng)價(jià)靈芝品質(zhì)優(yōu)劣的關(guān)鍵因素.由于各地的氣候和地理環(huán)境不同，靈芝加工品制作工藝不同，靈芝生物活性物質(zhì)分離純化技術(shù)不成熟等原因[13]，導(dǎo)致靈芝品種之間存在差異，GLP的含量也千差萬(wàn)別.因此，針對(duì)其有效活性物質(zhì)的合成途徑、關(guān)鍵酶的功能鑒定、代謝機(jī)制及高表達(dá)的研究成為近幾年的熱門(mén)課題[14-16].

紫外-可見(jiàn)分光光度法和高效液相色譜法是目前使用較多的檢測(cè)GLP含量的方法.本實(shí)驗(yàn)采用紫外-可見(jiàn)分光光度法定量檢測(cè)GLP含量，相比高效液相色譜法具有快速、簡(jiǎn)單、性?xún)r(jià)比高等優(yōu)點(diǎn)[17].苯酚-硫酸與糖類(lèi)可生成黃橙色化合物，在490 nm處可以檢測(cè)到吸光度，根據(jù)這個(gè)原理檢測(cè)GLP，最后根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出不同地源GLP含量[18].

本研究采集來(lái)自我國(guó)靈芝主產(chǎn)區(qū)樣本，包括吉林長(zhǎng)白山、云南文山.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同來(lái)源的GLP含量差異較大，其中以吉林靈芝孢子粉GLP平均含量最高(3.361%).長(zhǎng)白山地區(qū)夏季晝夜溫差大，冬季嚴(yán)寒漫長(zhǎng)，獨(dú)特的森林資源，充足的地下水和肥沃的有機(jī)黑色土壤都為孕育高品質(zhì)的靈芝提供了優(yōu)良的自然環(huán)境，該地區(qū)靈芝孢子粉多糖含量相對(duì)較高[5，19].

靈芝孢子是靈芝成熟期從靈芝菌褶中彈射出來(lái)的極其微小的卵形生殖細(xì)胞，即靈芝的種子.靈芝孢子粉具有靈芝的全部遺傳物質(zhì)和保健作用，其藥用價(jià)值日益受到重視，研究[20-22]發(fā)現(xiàn)：靈芝孢子具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑制腫瘤、保護(hù)肝損傷、輻射防護(hù)等作用.目前，市面上靈芝孢子粉價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于子實(shí)體，市場(chǎng)上的靈芝孢子粉主要為普通靈芝孢子粉和靈芝孢子粉(破壁).而靈芝孢子粉(破壁)的市場(chǎng)價(jià)值明顯高于靈芝子實(shí)體和未破壁靈芝孢子粉，現(xiàn)已成為市場(chǎng)上的主流產(chǎn)品[23].《國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委辦公廳關(guān)于破壁靈芝孢子粉有關(guān)問(wèn)題的復(fù)函》(國(guó)衛(wèi)辦食品函〔2014〕390號(hào))已明確，破壁靈芝孢子粉不宜作為普通食品原料，食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)企業(yè)不得使用破壁靈芝孢子粉作為原料生產(chǎn)加工普通食品，不得經(jīng)營(yíng)含破壁靈芝孢子粉的普通食品.《2020年中國(guó)靈芝行業(yè)市場(chǎng)研究報(bào)告》顯示：目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)數(shù)量及靈芝產(chǎn)品種類(lèi)繁多.根據(jù)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局網(wǎng)站披露信息，截至2018年12月底，有藥品批文或保健食品批文的靈芝及靈芝孢子粉產(chǎn)品分別有187個(gè)和1 157個(gè)，僅靈芝孢子粉每年產(chǎn)值近上百億元.由于利益驅(qū)動(dòng)，市場(chǎng)上靈芝孢子粉產(chǎn)品質(zhì)量參差不一.我國(guó)2012年公布的《靈芝孢子粉采收集加工技術(shù)規(guī)范》(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 29344-2012)要求以顯微鏡形態(tài)觀(guān)察計(jì)算靈芝孢子數(shù)量為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).隨著孢子粉采收及深加工技術(shù)的不斷升級(jí)，以及人們對(duì)孢子粉品質(zhì)的要求越來(lái)越高，以GLP為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)會(huì)很快納入孢子粉新的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).

GLP的合成是涉及多個(gè)基因表達(dá)調(diào)控的過(guò)程，其中與UGPase的催化密不可分[24-26].由于本實(shí)驗(yàn)只涉及了UGPase基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，不同靈芝菌株間UGPase基因mRNA表達(dá)量存在顯著差異，差異原因及具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究.