劉元，郝惠陽(yáng)，暴悅梅，王玥瑋

（天津市食品研究所有限公司，天津 301609）

隨著禽蛋產(chǎn)量的不斷增加，大量的蛋殼被廢棄，污染環(huán)境的同時(shí)資源也未得到有效利用。廢棄雞蛋殼中含有大量的鈣類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、活性肽等功能成分，具有一定的深加工價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)外專家、學(xué)者的研究主要集中在蛋殼粉的利用、蛋殼制備有機(jī)酸鈣、蛋殼內(nèi)膜及殘留蛋清的利用等4個(gè)方面[1]。其中，蛋殼內(nèi)膜的深加工利用成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。蛋殼膜俗稱“鳳凰衣”，存在于蛋清和蛋殼之間，由直徑為2 μm的纖維組成，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是一種雙層水不溶性膜，分為內(nèi)膜和外膜，外膜的厚度為50 μm～70 μm，而內(nèi)膜為15 μm～30 μm[2]。蛋殼膜主要是由角膜和黏多糖類相結(jié)合組成的復(fù)合蛋白質(zhì)，其中含有乙酰氨基葡萄糖半乳糖硫酸軟骨素、氨基酸等可溶性高分子化合物[3-6]。雞蛋殼膜還含有多種氨基酸，且根據(jù)最新研究結(jié)果顯示，蛋殼膜主要由高度交聯(lián)的半胱氨酸組成[7]。

由于雞蛋殼膜具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與生物活性，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)境工程、輕工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域[8]。本研究采用乙酸-酶解聯(lián)用分段提取技術(shù)，對(duì)雞蛋殼膜進(jìn)行深加工，提高了雞蛋殼膜蛋白的提取率，具有廣闊的市場(chǎng)前景和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)了廢棄蛋殼綜合利用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

雞蛋殼（碳酸鈣93%，磷酸鈣及磷酸3%，其它4%）：天津市食品集團(tuán)提供。

1.1.2 主要試劑

胃蛋白酶[1∶10 000（NFU/mg）]：龐博生物酶制劑有限公司；乙酸（分析純）、考馬斯亮藍(lán)G250、磷酸（分析純）、乙醇（分析純）、氯化鈉（分析純）、硫酸（優(yōu)級(jí)純）、硼酸（分析純）、鹽酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（2 mg/mL）：上海澤葉生物科技有限公司。

1.1.3 儀器

UV-3000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；AG204型電子天平（0.000 1 g）：瑞士Mettle Toledo公司；HZY-223-323型電子天平（0.001 g）：福州華志科學(xué)儀器有限公司；101-3-S型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；FN-200型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HH-6型恒溫水浴鍋：南京市新瑞儀器廠；L2-6K型離心機(jī)：湖南可成儀器設(shè)備有限公司；SHZ-C往復(fù)式水浴恒溫振蕩器：紹興上虞艾科儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

樣品預(yù)處理工藝流程：雞蛋殼（帶殼膜）→清洗→加水?dāng)嚢杵扑椤∩细〉臍つぁ础?5℃烘干→粉碎→過(guò)50目篩→備用。

1.2.2 試驗(yàn)試劑的制備

考馬斯亮藍(lán)G250染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)G250 100 mg溶于50 mL 95%的乙醇中，加入100 mL 85%的磷酸，用蒸餾水稀釋至1 000 mL[9]。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：根據(jù)其純度用0.15 mol/LNaCl溶液配制成1.0 mg/mL牛血清蛋白溶液。

1.2.3 可溶性蛋白質(zhì)的測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取7支試管，按照0～6進(jìn)行標(biāo)號(hào)，按照順序依次加入 0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.00 mL0.15 mol/L NaCl溶液，每支試管加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻，5 min后以0號(hào)管為空白對(duì)照，在595 nm處測(cè)定溶液的吸光值，并以吸光值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Protein standard curve

經(jīng)數(shù)據(jù)分析，其回歸方程為y=3.515x+0.017 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。

1.2.3.2 樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

取0.3 mL的樣品，同1.2.3.1試驗(yàn)方法，根據(jù)所測(cè)定的595 nm處吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，計(jì)算出樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。

1.2.3.3 雞蛋殼膜蛋白提取率

采用微量凱式定氮法及考馬斯亮藍(lán)G250法[11]分別測(cè)定雞蛋殼膜樣品及雞蛋殼膜蛋白提取液的蛋白質(zhì)含量，按姜莉[12]的方法計(jì)算相應(yīng)提取率，計(jì)算公式如下。

蛋白質(zhì)提取率/%=提取液蛋白質(zhì)含量×提取液體積/（蛋殼膜的蛋白質(zhì)含量×蛋殼膜質(zhì)量）×100

1.2.4 乙酸提取蛋白的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 提取液（乙酸）濃度對(duì)蛋白提取率的影響

稱取一定量的雞蛋殼膜粉末，按照液料比為100∶1（mL/g）加入到乙酸中（設(shè)定乙酸濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L），置于80℃的恒溫振蕩器中連續(xù)反應(yīng)5 h取出，離心、定容，采用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定溶液中的蛋白質(zhì)含量，以提取率為指標(biāo)，確定適宜的乙酸濃度。

1.2.4.2 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響

稱取一定量的雞蛋殼膜粉末，按照液料比為100∶1（mL/g）加入到1.5 mol/L乙酸中，置于恒溫振蕩器中連續(xù)反應(yīng)5h取出（設(shè)定溫度分別為50、60、70、80、90℃），離心、定容，采用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定溶液中的蛋白質(zhì)含量，以提取率為指標(biāo)，確定適宜的提取溫度。

1.2.4.3 液料比對(duì)蛋白提取率的影響

稱取一定量的雞蛋殼膜粉末，分別按照液料比為40∶1、60∶1、80∶1、100∶1、120∶1（mL/g）加入到 1.5 mol/L 乙酸中，置于70℃的恒溫振蕩器中連續(xù)反應(yīng)5 h取出，離心、定容，采用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定溶液中的蛋白質(zhì)含量，以提取率為指標(biāo)，確定適宜的液料比。

1.2.4.4 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

稱取一定量的雞蛋殼膜粉末，分別按照液料比為100∶1（mL/g）加入到 1.5 mol/L 乙酸中，置于 70 ℃的恒溫振蕩器中連續(xù)反應(yīng) 2、3、4、5、6 h 取出，離心、定容，采用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定溶液中的蛋白質(zhì)含量，以提取率為指標(biāo)，確定適宜的提取時(shí)間。

1.2.4.5 乙酸提取可溶性雞蛋殼膜蛋白的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙酸濃度、提取溫度、液料比、提取時(shí)間為試驗(yàn)因素，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以確定乙酸提取可溶性雞蛋殼膜蛋白的最佳提取工藝條件。正交試驗(yàn)因素與水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental factors and level

1.2.5 胃蛋白酶提取蛋白的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5.1 酶添加量對(duì)蛋白提取率的影響

稱取一定量乙酸提取后的雞蛋殼膜殘?jiān)?，在提取時(shí)間為5 h，提取溫度為40℃，底物濃度6%，pH2.0條件下，選擇不同的酶添加量（400、600、800、1 000、1 200 U/g）進(jìn)行提取反應(yīng)，之后90℃滅酶，離心，調(diào)節(jié)pH值至7.0，計(jì)算雞蛋殼膜蛋白提取率。

1.2.5.2 底物濃度對(duì)蛋白提取率的影響

稱取一定量乙酸提取后的雞蛋殼膜殘?jiān)?，在提取時(shí)間為5 h，提取溫度為40℃，酶添加量800 U/g，pH2.0條件下，選擇不同的底物濃度（2%、4%、6%、8%、10%），進(jìn)行提取反應(yīng)，之后90℃滅酶，離心，調(diào)節(jié)pH值至7.0，計(jì)算雞蛋殼膜蛋白提取率。

1.2.5.3 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響

稱取一定量乙酸提取后的雞蛋殼膜殘?jiān)?，在提取時(shí)間為5 h，底物濃度6%，酶添加量800 U/g，pH2.0條件下，選擇不同的提取溫度（30、35、40、45、50 ℃），進(jìn)行提取反應(yīng)，之后90℃滅酶，離心，調(diào)節(jié)pH值至7.0，計(jì)算雞蛋殼膜蛋白提取率。

1.2.5.4 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

稱取一定量乙酸提取后的雞蛋殼膜殘?jiān)跍囟葹?0℃，底物濃度6%，酶添加量800 U/g，pH2.0條件下，選擇不同的提取時(shí)間（2、3、4、5、6 h），進(jìn)行提取反應(yīng)，之后90℃滅酶，離心，調(diào)節(jié)pH值至7.0，計(jì)算雞蛋殼膜蛋白提取率。

1.2.5.5 pH值對(duì)蛋白提取率的影響

稱取一定量乙酸提取后的雞蛋殼膜殘?jiān)?，在提取溫度?0℃，底物濃度6%，酶添加量800 U/g，提取時(shí)間 5 h條件下，選擇不同的 pH 值（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5），進(jìn)行提取反應(yīng)，之后90℃滅酶，離心，調(diào)節(jié)pH值至7.0，計(jì)算雞蛋殼膜蛋白提取率。

1.2.5.6 胃蛋白酶提取可溶性雞蛋殼膜蛋白的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶添加量、底物濃度、提取溫度、提取時(shí)間為試驗(yàn)因素。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以確定胃蛋白酶提取可溶性雞蛋殼膜蛋白的最佳工藝條件。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 2 Orthogonal experimental factors and level

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SAS軟件和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酸提取雞蛋殼膜蛋白的試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.1.1 提取液（乙酸）濃度對(duì)蛋白提取率的影響

乙酸濃度對(duì)蛋白提取的影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙酸濃度對(duì)蛋白提取的影響Fig.2 Effect of acetic acid concentration on protein extraction

由圖2可知，隨著乙酸濃度的增加，蛋白提取率也在增加，這是由于酸法提取是利用一定離子濃度的酸性條件破壞分子間的化學(xué)鍵，而引起纖維膨脹、溶解，且酸法提取可以最大程度地保持蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)，利于進(jìn)一步提取活性物質(zhì)[13-15]。當(dāng)乙酸濃度到1.5 mol/L后，曲線變化平緩。綜合考慮，確定乙酸濃度為1.5 mol/L為最佳乙酸濃度。

2.1.2 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響

提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)蛋白提取的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on protein extraction

由圖3可知，在提取溫度為50℃～60℃時(shí)，提取率增長(zhǎng)較為平緩。這是由于雞蛋殼膜具有高度交聯(lián)的纖維結(jié)構(gòu)，不易溶解。當(dāng)提取溫度達(dá)到70℃時(shí)，其提取率顯著增加，這是由于在高溫條件下，雞蛋殼膜中的二硫鍵因還原反應(yīng)逐漸斷裂，致使雞蛋殼膜結(jié)構(gòu)逐步變薄、溶解。當(dāng)提取溫度超過(guò)70℃后，蛋白質(zhì)提取率增長(zhǎng)平緩，這可能是由于蛋白質(zhì)因?yàn)闇囟冗^(guò)高發(fā)生變性，使蛋白質(zhì)分子過(guò)度聚合導(dǎo)致。故在選擇雞蛋殼膜提取時(shí)的最佳溫度為70℃[10]。

2.1.3 液料比對(duì)蛋白提取率的影響

液料比對(duì)蛋白提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 液料比對(duì)蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-material ratio on protein extraction rate

由圖 4 可知，當(dāng)液料比為 100∶1（mL/g）時(shí)，雞蛋殼膜蛋白提取率曲線達(dá)到頂峰。底物濃度對(duì)于反應(yīng)的速率影響較大，這可能是由于當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾訒r(shí)，底物的黏度也隨之增加，這有礙于提取劑與底物的充分接觸，進(jìn)而造成蛋白質(zhì)提取率降低。因此，選用液料比為100∶1（mL/g）。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on protein extraction rate

由圖5可知，蛋白質(zhì)提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷提高，但當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)4 h后，蛋白質(zhì)提取率基本趨于穩(wěn)定。綜合考慮，選擇提取時(shí)間為4 h為宜。

2.1.5 乙酸提取可溶性雞蛋殼膜蛋白的最佳工藝條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果如表3～表4所示。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差Table 3 Results of orthogonal test and range

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance

由表3可知，4個(gè)因素對(duì)蛋白提取率影響的重要性依次為B提取溫度>A乙酸濃度>C液料比>D提取時(shí)間。由表4可知，提取溫度對(duì)蛋白提取率具有顯著的影響，其影響在4個(gè)因素中相對(duì)最大。通過(guò)對(duì)比k值可以得到各因素最佳水平為A2B2C3D2，即理論優(yōu)化工藝條件為乙酸濃度1.5 mol/L，提取溫度為70℃，液料比為 110∶1（mL/g），提取時(shí)間為 4 h。在此條件下蛋白提取率為17.2%，提取率明顯高于正交試驗(yàn)中最優(yōu)組合A2B2C3D1（16.5%）。

2.2 胃蛋白酶提取雞蛋殼膜蛋白的試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.2.1 酶添加量對(duì)蛋白提取率的影響

酶添加量對(duì)蛋白提取率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 酶添加量對(duì)蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of enzyme addition amount on protein extraction rate

由圖6可知，隨著酶添加量的增加，雞蛋殼膜蛋白提取率也隨之提高。當(dāng)酶添加量大于800 U/g時(shí)，提取率增長(zhǎng)緩慢。綜合考慮，選取酶添加量為800 U/g。

2.2.2 底物濃度對(duì)蛋白提取率的影響

底物濃度對(duì)蛋白提取率的影響見(jiàn)圖7。

圖7 底物濃度對(duì)蛋白提取率的影響Fig.7 Effect of substrate concentration on protein extraction rate

由圖7可知，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾訒r(shí)，蛋白質(zhì)提取率呈下降趨勢(shì)，這可能是由于底物濃度較高時(shí)，整個(gè)反應(yīng)體系較為濃稠，提取劑不能均勻地分散在體系之中，提取劑與雞蛋殼膜殘?jiān)貌坏匠浞纸佑|。因此不利于反應(yīng)的充分進(jìn)行。但經(jīng)綜合考慮，底物濃度過(guò)低時(shí)，試劑不能有效利用，造成資源浪費(fèi)。因此底物濃度選擇為4%～6%。

2.2.3 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響

提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響見(jiàn)圖8。

圖8 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響Fig.8 Effect of extraction temperature on protein extraction rate

由圖8可知，提取溫度對(duì)雞蛋殼膜蛋白提取率的影響顯著，當(dāng)提取溫度較低時(shí)，由于酶活力不足，提取率也不高。當(dāng)提取溫度升至35℃～40℃時(shí)，其提取率接近峰值。提取溫度超過(guò)40℃以后，胃蛋白酶的活性受到抑制，提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此雞蛋殼膜蛋白二次提取的適宜溫度為35℃～40℃。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響見(jiàn)圖9。

圖9 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響Fig.9 Effect of extraction time on protein extraction rate

由圖9可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，雞蛋殼膜蛋白的提取率也不斷提高，但達(dá)到5 h以后，提取率增長(zhǎng)趨于平緩。因此本試驗(yàn)選取提取時(shí)間為4 h～5 h。

2.2.5 pH值對(duì)蛋白提取率的影響

pH值對(duì)蛋白提取率的影響見(jiàn)圖10。

圖10 pH值對(duì)蛋白提取率的影響Fig.10 Effect of pH value on protein extraction rate

由圖10可知，當(dāng)溶液的pH值在1.5～2.5之間時(shí)，蛋白提取率逐漸升高。pH值在2.5～3.5之間時(shí)，提取率有下降趨勢(shì)，故選取pH值為2.5的乙酸溶液作為本試驗(yàn)的提取劑。

2.2.6 胃蛋白酶提取殼膜蛋白的最佳工藝條件

正交試驗(yàn)結(jié)果及各因素對(duì)提取條件的方差分析如表5～表6所示。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差Table 5 Results of orthogonal test and range

表6 方差分析結(jié)果Table 6 Analysis of variance

由表5可知，4個(gè)因素對(duì)蛋白提取率影響的重要性依次為B底物濃度>A酶添加量>D提取時(shí)間>C提取溫度。由表6可知，4個(gè)因素對(duì)蛋白提取率均無(wú)顯著影響。通過(guò)對(duì)比K值得到各因素最佳水平為A1B3C2D2，即理論優(yōu)化提取條件為酶添加量800 U/g，底物濃度6%，提取溫度為38℃，提取時(shí)間5 h。在此條件下蛋白提取率最高為74.2%，高于正交試驗(yàn)中最優(yōu)工藝A1B2C2D2（73.1%）。

綜合一次及二次提取，可使雞蛋殼膜蛋白的提取率高達(dá)91.4%。

3 結(jié)論

本研究采用乙酸-酶解聯(lián)用分段提取技術(shù)對(duì)廢棄雞蛋殼進(jìn)行深加工，研究乙酸-胃蛋白酶提取蛋白。結(jié)果表明，乙酸提取過(guò)程中，最優(yōu)工藝條件為乙酸濃度1.5 mol/L、提取溫度為 70 ℃、液料比為 110∶1（mL/g）、提取時(shí)間為4 h。在此條件下蛋白提取率為17.2%。胃蛋白酶提取過(guò)程中，最優(yōu)提取條件為酶添加量800 U/g、底物濃度6%、提取溫度為38℃、提取時(shí)間5 h。在此條件下蛋白提取率最高為74.2%。綜合一次及二次提取，雞蛋殼膜蛋白的提取率可高達(dá)91.4%。