吳嘉利 張小波 胡杰 李夢 景志賢 袁強 李石清 張春椿

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053 2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心 3.杭州第一技師學(xué)院

浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.）是百合科（Liliaceae）植物浙貝母的干燥鱗莖，為我國常用的傳統(tǒng)中藥材，原產(chǎn)地為寧波象山，是著名的“浙八味”之一[1]，其性寒，味苦，歸肺、心經(jīng)，具有清熱化痰止咳、解毒散結(jié)的功效，在臨床上廣泛應(yīng)用，常用于治療風(fēng)熱咳嗽、痰火咳嗽、肺癰、乳癰、瘰疬、瘡毒等疾病[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，浙貝母主要藥用成分為貝母素甲、貝母素乙等生物堿類[3-5]。

中藥區(qū)劃是指以中藥資源和中藥生產(chǎn)地域系統(tǒng)為研究對象，通過分析中藥資源區(qū)域分布和中藥生產(chǎn)特征，依據(jù)區(qū)域相似性和區(qū)級差異性原理，將全國劃分成不同等級的區(qū)域，以指導(dǎo)中藥資源保護管理、開發(fā)利用和中藥生產(chǎn)[6-7]。中藥材生產(chǎn)適宜性區(qū)劃是利用地理信息系統(tǒng)（Geographic Information System，GIS）的疊加分析等功能，在生態(tài)適宜性的基礎(chǔ)上，結(jié)合全國中藥資源空間信息網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中的信息，對區(qū)域進行劃分[8]。近年來，中藥資源需求飛速增長，大量中藥材道地產(chǎn)區(qū)的經(jīng)濟及生態(tài)環(huán)境發(fā)生重大改變，部分藥材產(chǎn)地也在發(fā)生變遷，但盲目引種和擴種可能影響中藥材質(zhì)量。特定的生態(tài)環(huán)境是道地藥材形成的重要條件，因此在引種、擴種前需要對中藥材生產(chǎn)進行合理布局，以促進中藥材產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[9]。浙貝母就是一個典型的例子，隨著浙貝母種植面積的迅速擴大，種植地土壤和氣候因素的變化，浙貝母質(zhì)量存在不穩(wěn)定性。毛劍飛等[10]研究表明，平均氣溫在17℃左右時，地上部莖葉生長迅速；超過20℃，生長緩慢并隨氣溫繼續(xù)升高而枯萎；高于30℃或低于4℃則生長停止；而地下鱗莖于10～25℃時正常膨大，高于25℃地下鱗莖進入休眠，-6℃鱗莖受凍。浙貝母喜歡濕潤氣候，所需土壤最佳含水量在20%～30%，用帶沙質(zhì)的輕黏土栽培最佳[11]。筆者團隊于浙貝母主產(chǎn)區(qū)浙江和江蘇兩省采集浙貝母鮮品，通過統(tǒng)計分析得到主導(dǎo)因子，并利用GIS技術(shù)對浙貝母品質(zhì)進行區(qū)劃研究，這將有利于為浙貝母的種植規(guī)劃和基于化學(xué)成分含量的生產(chǎn)布局提供科學(xué)依據(jù)[12]。

1 材料和方法

1.1 藥材樣品和生態(tài)環(huán)境數(shù)據(jù) 2020年5月分別于浙江省和江蘇省的32個樣點采集浙貝母藥材，每個樣點3株，并記錄藥材樣品采集地的經(jīng)緯度和海拔等位置信息。

通過中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心“中藥資源空間信息網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫”獲取浙江省和江蘇省的生態(tài)因子數(shù)據(jù)。其中氣候因子來自全國氣候數(shù)據(jù)網(wǎng)站，系通過全球已有的最新氣候站點數(shù)據(jù)，采用經(jīng)度、緯度和海拔三維地理空間進行插值得到的，空間分辨率為1km2。

1.2 試劑和儀器 貝母素甲（色譜純）、貝母素乙（色譜純）對照品均購于上海詩丹德生物技術(shù)有限公司（批號：ST00370120MG、ST00380120MG）；甲醇（分析純）購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司（批號：20150702）；三氯甲烷（分析純）購于西隴化工股份有限公司（批號：20150521）；甲醇（色譜純）購于天津四友精細化學(xué)品有限公司（批號：503332-09547）；純凈水選用娃哈哈純凈水。Waters1525高效液相色譜儀和Empower2色譜工作站均購于美國Waters公司；Hypersil C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）購于大連依利特分析儀器有限公司；SEDEX LT-ELSD型蒸發(fā)光散射檢測器為北京迪科馬科技有限公司產(chǎn)品；KQ2200DA型數(shù)控超聲波清洗器購于昆山市超聲儀器有限公司；AR224CN電子分析天平為奧豪斯儀器上海有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 生物堿成分含量的測定

1.3.1.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為A（乙腈）和B（0.05%三乙胺-水），梯度洗脫0～5min，55%A；5～7min，55%～75%A；7～18min，85%A，流速為1mL·min-1，柱溫30℃，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection，HPLC-ELSD）檢測。漂移管溫度55℃，載氣40psi，增益10。

1.3.1.2 供試品溶液制備 取采集的浙貝母供試品粉末約2.0g，過4號篩，精密稱量，并置于錐形瓶中，加入濃氨水4mL，浸潤30min，再精密加入氯仿-甲醇（4:1）的混合溶液40mL，精密稱重，混勻。將上述溶液置于超聲器中超聲1.0h，靜置冷卻，再次稱重后，加入上述混合溶液補足重量，濾過。精密量取濾液10mL，置于蒸發(fā)皿中蒸干，以甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至5L容量瓶中，再以甲醇定容并搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，靜置備用。

1.3.1.3 對照品儲備液制備 取貝母素甲、貝母素乙對照品適量，精密稱定后加入甲醇溶液，制成1mL含貝母素甲0.20mg、貝母素乙0.29mg的混合對照品儲備液。

1.3.1.4 線性關(guān)系考察 分別準確吸取混合對照品儲備液適量，以甲醇稀釋定容后，得到5個不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。在本實驗的色譜條件下，分別對各質(zhì)量濃度對照品溶液進行進樣分析，按上述條件測定峰面積。并以對照品溶液濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸分析。

1.3.1.5 供試品測定 取不同產(chǎn)地浙貝母供試品粉末，按1.3.1.2中的方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20μL，注入高效液相色譜儀，用標準曲線法分別計算各供試品中貝母素甲、貝母素乙的含量。

1.3.2 浙貝母分布區(qū)劃 基于浙貝母分布信息和浙江省與江蘇省的中藥資源普查實地調(diào)查數(shù)據(jù)庫[13]，獲取浙貝母的分布信息，利用最大信息熵模型的迭代運算，進行浙貝母潛在分布區(qū)劃。對有異議的區(qū)域進行驗證核實，完成浙貝母分布區(qū)劃圖制作[14]。

1.3.3 浙貝母品質(zhì)區(qū)劃 中藥品質(zhì)區(qū)劃是以中藥品質(zhì)評價指標為基礎(chǔ)，采用逐步回歸、相關(guān)分析等統(tǒng)計學(xué)方法，分析中藥材品質(zhì)評價指標與生態(tài)因子之間的相關(guān)性，并構(gòu)建品質(zhì)評價指標與生態(tài)因子之間的關(guān)系模型[15]。

本文以浙貝母中貝母素甲、貝母素乙兩種生物堿的含量作為品質(zhì)評價指標，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行相關(guān)性分析，從而研究兩種生物堿與生態(tài)因子之間的相關(guān)性；再利用逐步回歸分析，研究并構(gòu)建貝母素甲和貝母素乙與生態(tài)因子之間的關(guān)系模型。基于關(guān)系模型，應(yīng)用Arc地理信息系統(tǒng)（Arc Geographic Information System，ArcGIS）10.2的柵格計算方法，估算全國范圍內(nèi)浙貝母中兩種生物堿的空間分布情況。

2 結(jié)果

2.1 樣品和生境信息 通過實地調(diào)查，共獲得浙江和江蘇兩省共96份樣品的地理位置信息，4個土壤數(shù)據(jù)（含沙量、含黏土量、土壤類型、質(zhì)地類型）和16個氣候因子數(shù)據(jù)（年均降水量、晝夜溫差月均值、相對濕度、等溫線、輻射、日照、1～5月平均氣溫和1～5月平均降水量）。

2.2 生物堿含量的測定

2.2.1 高效液相色譜分離 精密吸取混合對照品和供試品溶液各20μL，在1.3.1.1中的色譜條件下進行含量測定，得到混合對照品和供試品的色譜圖。見圖1、2。結(jié)果表明，該色譜條件對混合對照品及供試品所測的貝母素甲和貝母素乙的分離效果較好，均達到基線分離，且基線平穩(wěn)。

圖1 混合對照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard

圖2 供試品色譜圖Fig.2 Chromatogram of test sample

2.2.2 線性關(guān)系考察 通過計算得到貝母素甲的回歸方程y=1.6859x+6.6653，R2=0.9994，表明貝母素甲質(zhì)量濃度在0.00596～0.1192mg·mL-1范圍內(nèi)，供試品濃度和貝母素甲峰面積之間具有良好的線性關(guān)系；貝母素乙的回歸方程y=1.7053x+6.5894，R2=0.9994，表明貝母素乙質(zhì)量濃度在0.0412～0.0824mg·mL-1范圍內(nèi)，供試品濃度和貝母素乙峰面積之間具有良好的線性關(guān)系。見表1。

表1 貝母素甲、貝母素乙的線性關(guān)系考察Tab.1 Study on the linear relationship between peimine and peiminine

2.2.3 不同產(chǎn)地浙貝母中生物堿含量 浙江省共12個產(chǎn)地的浙貝母符合藥典要求，江蘇省9個產(chǎn)地的浙貝母符合藥典要求，其余11個產(chǎn)地的浙貝母中貝母素甲、貝母素乙的總含量小于0.08%，未達到藥典要求。見表2。

表2 不同產(chǎn)地浙貝母樣品中貝母素甲和貝母素乙的含量（%）Tab.2 Contents of peimine， peiminine in Fritillaria thunbergii Miq.from different places（%）

2.3 浙貝母分布區(qū)劃 通過實地調(diào)查，獲得兩個省份32個產(chǎn)地的浙貝母地理分布數(shù)據(jù)，并利用最大信息熵模型，計算得到浙貝母的空間分布概率區(qū)劃圖。見圖3。由圖3可知，浙貝母分布適宜度較高的區(qū)域在浙江中東部和北部，以及江蘇的東部。

圖3 浙貝母空間分布區(qū)劃Fig.3 Spatial distribution division of Fritillaria thunbergii Maximum information entropy distribution

2.4 浙貝母品質(zhì)區(qū)劃 基于樣品的地理位置、土壤以及氣候因子數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，采用相關(guān)性分析法，對32個采樣點的貝母素甲、貝母素乙含量與氣象因子之間的相關(guān)性進行分析，結(jié)果表明貝母素甲含量與年均降水量、月晝夜溫差、相對濕度及月平均氣溫顯著相關(guān)；貝母素乙含量與年均降水量、相對濕度顯著相關(guān)。

分別設(shè)貝母素甲為Y1，貝母素乙為Y2，相對濕度為X1，年均降水量為X2，月晝夜溫差為X3，月平均氣溫為X4，采用逐步回歸分析法，對貝母素甲、貝母素乙含量與年均降水量、月晝夜溫差、相對濕度、月平均氣溫等環(huán)境因子間的關(guān)系進行分析，構(gòu)建化學(xué)成分與生態(tài)因子的關(guān)系模型。結(jié)合ArcGIS 10.2軟件的空間計算功能，估算各個有效成分的空間分布情況，貝母素甲、貝母素乙的空間分布情況結(jié)果分別見圖4、5。

圖4 貝母素甲含量空間分布Fig.4 Spatial distribution of content of peimine in Fritillaria thunbergii Miq.

回歸方程Y1=0.003+1.081×10-5X1-6.440×10-7X2-1.264×10-5X3-7.814×10-6X4（Y1：貝母素甲，X1：相對濕度，X2：年均降水量，X3：月晝夜溫差，X4：月平均氣溫），R2=0.645，模型擬合程度較好，故可以進行貝母素甲的含量預(yù)測。

回歸方程Y2=0.001+5.587×10-6X1-4.470×10-7X2（Y2：貝母素乙，X1：相對濕度，X2：年均降水量），R2=0.370，模型擬合程度較好，故可以進行貝母素乙的含量預(yù)測。

2.5 浙貝母質(zhì)量適宜分布區(qū) 應(yīng)用ArcGIS 10.2軟件的空間計算功能，以全國740個氣象站的氣象數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，根據(jù)浙貝母中貝母素甲、貝母素乙和氣象因子的關(guān)系模型，估算浙江和江蘇兩省范圍內(nèi)浙貝母中的貝母素甲和貝母素乙的含量。同時，以貝母素甲和貝母素乙總量大于0.08%作為適宜區(qū)的標準，將其分為適宜區(qū)和不適宜區(qū)。見圖6。

圖5 貝母素乙含量空間分布Fig.5 Spatial distribution of content of Peiminine in Fritillaria thunbergii Miq.

圖6 浙貝母適宜分布區(qū)Fig.6 Suitable distribution area of Fritillaria thunbergii Miq.

3 討論

相關(guān)研究表明，不同地區(qū)的浙貝母品質(zhì)存在一定差異[16-17]。本課題組采集浙江省和江蘇省32個產(chǎn)地的浙貝母，對浙貝母中貝母素甲和貝母素乙的成分含量進行分析研究。結(jié)果表明不同產(chǎn)地所產(chǎn)浙貝母中生物堿的含量差別較大，江蘇和浙江兩省共21個產(chǎn)地的浙貝母中生物堿含量符合藥典要求，其余11個產(chǎn)地的浙貝母中貝母素甲、貝母素乙的總含量可能因為土壤中微量元素較少，水分、日照不充足等原因沒有達到藥典要求。因此，選取生態(tài)因子與最適宜條件相似性高的地區(qū)發(fā)展種植，才能有效保證藥材品質(zhì)。

貝母素甲含量較高的浙貝母分布區(qū)集中在浙江中東部；貝母素乙含量較高的浙貝母分布區(qū)集中在浙江省東部和浙江、江蘇交界處，這與浙貝母產(chǎn)地的地形條件、氣候條件等生態(tài)因子息息相關(guān)。浙貝母的栽培及引種應(yīng)該首先綜合考慮年均降水量、月晝夜溫差、相對濕度、月平均氣溫這四個主導(dǎo)因素，浙江省的東部及北部和江蘇省的東部是浙貝母分布的適宜生長區(qū)域，以上結(jié)果可以為浙貝母的規(guī)范化種植和引種提供科學(xué)依據(jù)。

根據(jù)以上結(jié)論，最適宜的中藥分布區(qū)是先確定中藥材產(chǎn)地的環(huán)境因子和中藥品質(zhì)之間的關(guān)系模型，利用GIS技術(shù)，再根據(jù)面狀生態(tài)環(huán)境數(shù)據(jù)和關(guān)鍵模型進行空間計算，最后獲得品質(zhì)評價指標的空間分布情況[18-19]。該研究可為提升種植產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、改善人工栽培手段、增強資源可持續(xù)利用提供扎實的理論依據(jù)，并為后續(xù)浙貝母的綜合發(fā)展提供可靠的基礎(chǔ)。