劉雪梅 劉德亮 曾霖 李惠林 趙恒俠 張學(xué)文

摘要 目的：探討活血降糖飲治療糖尿病腎病的分子機(jī)制。方法：通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)加尾靜脈注射鏈脈佐菌素（STZ）等建立糖尿病腎病大鼠模型，并將模型大鼠隨機(jī)分為糖尿病腎?。―N）組、模型+雙胍+中藥組（DN+Met+ZY）、模型+雙胍+卡托普利組（DN+Met+CP），給予相應(yīng)藥物進(jìn)行灌胃治療，并另設(shè)正常對(duì)照組，每組10只，干預(yù)16周后，觀察各組大鼠空腹血糖（FBG）、血脂、血清尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、24 h尿總蛋白（24 h UTP）及尿微量清蛋白（24 h mALB）的變化。觀察腎組織病理改變，并對(duì)各組腎組織進(jìn)行RNA-seq測(cè)序。結(jié)果：與模型組比較，中藥組和卡托普利組可以顯著下調(diào)糖尿病腎病大鼠FBG、TC、TG、LDL-C、Scr、BUN、24 h UTP、24 h mALB等水平，而HDL-C無(wú)明顯變化;與卡托普利組之間比較，中藥組FBG、TC、TG、LDL-C明顯下降，HDL-c、Scr、BUN、24 h UTP、24 h mALB均無(wú)明顯差別。與模型組比較，中藥組和卡托普利組均可以顯著改善糖尿病腎病大鼠的腎臟病理學(xué)變化。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示模型組對(duì)比正常組與中藥組對(duì)比模型組轉(zhuǎn)錄本中基因總量接近，其中表達(dá)差異最明顯的雙向調(diào)控基因共篩選出10個(gè);京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）前20條顯著富集通路分析顯示模型組對(duì)比正常組與中藥組對(duì)比模型組共同作用的信號(hào)通路有代謝相關(guān)通路及cAMP信號(hào)通路。結(jié)論：活血降糖飲聯(lián)合二甲雙胍能改善糖尿病腎病大鼠的糖脂代謝紊亂，減少尿白蛋白的排泄，改善腎功能和腎臟病理改變，延緩糖尿病腎病病情進(jìn)展，其作用機(jī)制可能是通過(guò)Cftr、Pdk4、Angptl4、Hmgcs2等多靶點(diǎn)介導(dǎo)多通路實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞 活血降糖飲;糖尿病腎病;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù);二甲雙胍;糖尿病;鏈脲佐菌素;卡托普利

Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Huoxue Jiangtang Decoction in the treatment of diabetic nephropathy.Methods：The diabetic nephropathy model was established by feeding high fat diet and injecting streptozotocin （STZ） through tail vein.The model rats were randomly divided into a diabetic nephropathy （DN） group，a model+biguanide+traditional Chinese medicine （DN+Met+ZY） model+biguanide+captopril （DN+Met+CP） group.The corresponding drugs were given by gavage，and another normal control group was set up，with 10 rats in each group.The changes of fasting blood glucose （FBG），blood lipid，serum urea nitrogen （BUN），serum creatinine （SCR），24 h urinary protein （24 h UTP） and urinary microalbumin （24h mAlb） were observed.The pathological changes of renal tissue were observed，and RNA-seq sequencing was performed in each group.Results：Compared with the model group，the levels of FBG，TC，TG，LDL-C，SCR，bun，24 h UTP and 24 h mAlb were significantly decreased in the Chinese medicine group and captopril group，but HDL-C had no significant change; compared with captopril group，F(xiàn)BG，TC，TG and LDL-C in Chinese medicine group decreased significantly，while there were no significant difference in HDL-C，SCR，bun，24 h UTP and 24 h mAlb.Compared with the model group，the Chinese medicine group and captopril group can significantly improve the renal pathological changes of diabetic nephropathy rats.The results of transcriptome sequencing showed that the total number of genes in the transcripts of model group vs normal group and traditional Chinese medicine group vs model group was close，and 10 bidirectional regulatory genes with the most obvious expression difference were screened out; the analysis of the first 20 KEGG rich pathways showed that the metabolic pathway and cAMP signaling pathway were involved in the model group vs the normal group and the Chinese medicine group vs the model group.Conclusion：Huoxue Jiangtang Drink combined with metformin can improve the disorder of glucose and lipid metabolism，reduce the excretion of urinary albumin，improve renal function and pathological changes，and delay the progression of diabetic nephropathy.Its mechanism may be mediated by multiple pathways such as CFTR，PDK4，ANGPTL4 and hmgcs2 etc.

Keywords Huoxue Jiangtang Decoction; Diabetic nephropathy; Transcriptome sequencing technology; Metformin; Diabetes; Streptozotocin;Captopril

中圖分類(lèi)號(hào)：R255.4;R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.012

糖尿病是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝異常性疾病，以持續(xù)性高血糖為特征，是到目前為止影響人類(lèi)健康的一大慢性非傳染性疾病。其發(fā)病率隨著生活水平的不斷提高而逐步上升。而糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，在糖尿病患者中的發(fā)病率為20%～40%[1]，是導(dǎo)致終末期腎衰竭最常見(jiàn)的原因。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今仍未明了，是多因素共同作用的結(jié)果，所導(dǎo)致的主要病理改變?yōu)槟I臟肥大、腎小球和腎小管基底膜（GBM）增厚、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白積聚致系膜區(qū)擴(kuò)張，最終導(dǎo)致彌漫性或結(jié)節(jié)性腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化。目前對(duì)于DN的研究認(rèn)為，其發(fā)病可能與以下幾個(gè)機(jī)制有關(guān)：1）糖代謝異常導(dǎo)致的多元醇通路激活、蛋白激酶C的活化以及糖基化終產(chǎn)物的形成和堆積，導(dǎo)致早期腎小球高濾過(guò)、后期腎小球硬化[2-3];2）高糖引起高滲透壓導(dǎo)致腎血流量改變，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞損傷，AngⅡ、TGF-β過(guò)度表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增加，腎小球硬化[4];3）糖尿病時(shí)，體內(nèi)多種炎癥介質(zhì)導(dǎo)致腎小球損傷、加速腎小球硬化[5-6];4）其他因素包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、黏附分子等都參與DN的發(fā)生發(fā)展全過(guò)程。

目前治療DN主要是通過(guò)生活方式的改變以及控制血糖、血脂、血壓等加重DN病情的危險(xiǎn)因素，并采用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）降低腎小球壓力以減少蛋白尿的生成，而并無(wú)特效藥物。因此，尋求更多DN的治療方法實(shí)有必要。前期研究發(fā)現(xiàn)活血降糖飲能改善糖脂代謝及胰島素抵抗，提高胰島素敏感性，同時(shí)還能改善腎功能，緩解DN進(jìn)展[7-9]。本研究初步探討活血降糖飲對(duì)氣陰兩虛夾瘀型早期DN的可能作用機(jī)制;通過(guò)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)活血降糖飲能有效干預(yù)DN的生物信息學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取健康SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，4周齡，共40只，體質(zhì)量（170±10）g，均由中山大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（粵）2016-0029。動(dòng)物自由攝食、飲水，標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)環(huán)境下飼養(yǎng)。普通飲水和基礎(chǔ)飼料均由廣州永諾生物科技有限公司提供。本研究已通過(guò)廣東省深圳市中醫(yī)院倫理審查[倫理審批號(hào)：倫理發(fā)（2020年）8號(hào)]。

1.1.2 藥物 活血降糖飲（黃芪、太子參、丹參各30 g，牡丹皮、紅花、山藥各10 g，生地黃20 g，五味子、麥冬、黃精、熟大黃各15 g）由深圳市中醫(yī)院制劑室協(xié)助煎煮、過(guò)濾，濃縮成含生藥4 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。二甲雙胍為上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)的原料藥，用滅菌注射用水配制為25 mg/mL的溶液;卡托普利為上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)的原料藥，用滅菌注射用水配制為1.75 mg/mL的溶液。

1.3 試劑與儀器 血糖試劑（批號(hào)：SBJ-R0122）、血脂試劑（批號(hào)：SBJ-R0794）、尿素氮試劑（批號(hào)：SBJ-H2001）、肌酐（批號(hào)：SBJ-H1998）等試劑盒均購(gòu)自羅氏公司;鏈脲佐菌素（美國(guó)Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：S0130）;磷酸鹽緩沖液（PBS）（博士德公司，貨號(hào)：AR0194-10）;檸檬酸鹽緩沖液（批號(hào)：Q101977）、二甲苯（批號(hào)：2650-17-1）、無(wú)水乙醇（批號(hào)：E111963）、氯仿（批號(hào)：67-66-3）、異丙醇（批號(hào)：67-63-0）均購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠(chǎng);蘇木精染色液（廣州市秀威貿(mào)易有限公司，貨號(hào)：SY1438）;糖原PAS染色液試劑盒（批號(hào)：20170925）、Masson三色染色試劑盒（批號(hào)：G1340）均購(gòu)自Solarbio公司;Trizol（美國(guó)MRC公司，美國(guó)，貨號(hào)：TR118-100）。血糖儀（強(qiáng)生公司，美國(guó)，型號(hào)：穩(wěn)擇易ONETOUCH）;全自動(dòng)生化分析儀（羅氏公司，美國(guó)，型號(hào)：cobas 8000 c702）;顯微鏡OPTEC CCD TP510（奧特公司，美國(guó)，型號(hào)：OPTEC）;冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，德國(guó)，型號(hào)：5424R）;干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)：GY-2101）;微量定量檢測(cè)儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)：000001）;電泳儀（上海天能儀器有限公司，型號(hào)：EPS 600）;水平電泳槽（北京六一儀器有限公司，型號(hào)：DYCP-31A型）;凝膠成像系統(tǒng)（上海天能儀器有限公司，型號(hào)：Tanon-5200Multi）;2100生物分析儀（中國(guó)Agilent公司，型號(hào)：Agilent2100）;PCR儀（中國(guó)東勝龍儀器有限公司，型號(hào)：ETC811）;迷你離心機(jī)（杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)：Mini-15k）;渦旋振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)：MTV-1）;電子顯微鏡（上海易匯生物科技有限公司，型號(hào)：XTX-3C/NTB-2B）;電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社，日本，型號(hào)：JEM-1400 PLUS）;冰箱（Thermo公司，美國(guó)，型號(hào)：Thermo Scientific-80 ℃）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，稱(chēng)體質(zhì)量，隨機(jī)取10只作為正常組，制備模型大鼠30只。模型大鼠持續(xù)高脂喂養(yǎng)，正常組大鼠普通飼料喂養(yǎng)，4周后，模型大鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ）（30 mg/kg）（溶于0.1 mmol/L的檸檬酸緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用），正常組大鼠尾靜脈注射等體積的檸檬酸緩沖液。1周后，所有大鼠禁食12 h，麻醉后眼眶后靜脈叢采血測(cè)空腹血糖（FBG）。FBG>16.7 mmol/L者，且按上述喂養(yǎng)方法2周后同樣方法再次測(cè)FBG>16.7 mmol/L則認(rèn)為造模成功。

1.2.2 給藥方法 造模成功后，模型大鼠分為3組（每組10只）和正常大鼠10只，共有如下4組：1）正常組（Control）;2）模型組（DN）;3）模型+二甲雙胍+中藥（DN+Met+ZY）;4）模型+二甲雙胍+卡托普利組（DN+Met+Cap）。中藥按4 g/（kg·d）、二甲雙胍按250 mg/（kg·d）、卡托普利按17.5 mg/（kg·d）灌胃給藥，每周灌胃6 d，1次/d，期間正常喂食，記錄各組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量等變化，給藥16周后，監(jiān)測(cè)大鼠的FBG、24 h尿蛋白（24 h UTP）含量;1周后，禁食24 h，所有大鼠腹主動(dòng)脈采血后處死，收集血液、兩側(cè)腎皮質(zhì)。及尿微量清蛋白（24 h mALB）。

1.2.3 觀察指標(biāo)與方法

1.2.3.1 一般生化指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠腹主動(dòng)脈采血，收集血液樣本離心、取血清，用酶法及膽固醇氧化酶法檢測(cè)FBG、血脂代謝指標(biāo)（TC、TG、LDL-C、HDL-C）以及血清尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），并在羅氏全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。24 h UTP及24 h mALB均用免疫比濁法。

1.2.3.2 觀察腎皮質(zhì)病理的改變 取一側(cè)腎皮質(zhì)，分為2部分，其中一部分腎皮質(zhì)在固定、石蠟包埋后，進(jìn)行HE染色、PAS染色、Masson染色，觀察病理改變。

1.2.3.3 觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)的改變 另一部分腎皮質(zhì)通過(guò)透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)的改變。用鋒利刀片切取目標(biāo)病變部位的腎皮質(zhì)組織塊約1 mm3，不超米粒樣大小，經(jīng)2.5%中性戊二醛溶液前固定2 h、0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗、1%鋨酸后固定1.5～2 h、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗、梯度脫水、樹(shù)脂滲透、包埋、固化、半薄切片定位、超薄切片、鈾鉛雙染色等各步驟后，用電子顯微鏡觀察目標(biāo)結(jié)構(gòu)、調(diào)試電鏡至圖像清晰，采集需要的圖像。

1.2.3.4 RNA-seq測(cè)序

選擇正常組、模型組、模型+二甲雙胍+中藥組3組的另一側(cè)腎皮質(zhì)組織置-80 ℃冰箱，進(jìn)行RNA-seq測(cè)序。

1.2.3.4.1 組織細(xì)胞Total RNA的提取 取樣本25～50 mg，于研缽中液氮研磨成為粉末，轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入1 mL Trizol 1.5 mL EP管內(nèi)，迅速顛倒混勻。棄培養(yǎng)基，加入適量1×PBS（2 mL/25 mm 2培養(yǎng)瓶）洗滌細(xì)胞1遍。棄1×PBS，加入1 mL Trizol，反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶底部以使細(xì)胞裂解脫落，收集于1.5 mL離心管，用力震蕩混勻。加入200 μL氯仿，上下用力顛倒混勻30 s，靜置3 min。4 ℃，12 000×g離心15 min。此時(shí)可見(jiàn)裂解液分3層：上層水相的RNA;中層為DNA、脂類(lèi)等;下層為細(xì)胞殘?jiān)?、蛋白、多糖等。取上?00 μL到新的EP管內(nèi)，167 μL吸3次;加入等體積的異丙醇，混勻，靜置10 min后，4 ℃，12 000×g離心10 min。小心去掉上清，注意不要丟失RNA沉淀，加入1 mL 75%乙醇，上下顛倒，使沉淀塊重懸起。4 ℃，12 000×g離心10 min，小心去掉上清，盡量吸干管壁的液體，注意不要丟失RNA沉淀，若沉淀松動(dòng)可再次離心。晾干約15 min，至管壁無(wú)液體。加入適量體積（20～100 μL）的DEPC-H2O溶解RNA，58 ℃水浴10 min。取樣1 μL進(jìn)行分光光度計(jì)檢測(cè)，500 ng進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，500 ng進(jìn)行安捷倫2100生物分析儀檢測(cè)，剩余Total RNA樣本置于-80 ℃保存。

1.2.3.4.2 mRNA建庫(kù) 經(jīng)RNA提取、mRNA分離及片段化、一鏈cDNA合成、二鏈合成、二鏈產(chǎn)物純化、末端修復(fù)與加dA尾、Adapter連接、連接產(chǎn)物純化、片段選擇、PCR、PCR產(chǎn)物純化后建立mRNA庫(kù)。

1.2.3.4.3 Illumina HiSeqTM2000測(cè)序 由Illumina HiSeqTM2000測(cè)序得到數(shù)據(jù)Raw Reads，隨后要對(duì)Raw Reads進(jìn)行質(zhì)量控制（QC），以確定測(cè)序數(shù)據(jù)是否適用于后續(xù)分析，質(zhì)控后，經(jīng)過(guò)濾得到Clean Reads，用比對(duì)軟件將Clean Reads比對(duì)到參考序列。比對(duì)完，通過(guò)統(tǒng)計(jì)Reads在參考序列上的分布情況及覆蓋度，判斷比對(duì)結(jié)果是否通過(guò)第2次質(zhì)量控制（QC of alignment）。

1.2.3.5 基因表達(dá)量和差異表達(dá)基因分析 運(yùn)用SOAP[10]軟件將通過(guò)檢測(cè)的這些Clean Reads高效、準(zhǔn)確地比對(duì)到大鼠參考基因組序列上去，并用RSEM軟件計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)量，采用基于泊松分布原理的PossionDis法篩選差異表達(dá)基因[11]。

1.2.3.6 生物信息學(xué)分析 選擇大鼠腎皮質(zhì)組織不同樣本間差異表達(dá)的基因進(jìn)行基因功能（GO）富集分析和信號(hào)通路（Pathway）富集分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均值比較采用單因素方差分析，先行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊采用F檢驗(yàn)進(jìn)行總均值比較、SNK法進(jìn)行兩兩比較;方差不齊改用Welch檢驗(yàn)進(jìn)行總體均值比較、Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 各組大鼠糖脂代謝指標(biāo)的比較 與正常組比較，模型組大鼠的FBG、TG、TC、LDL-C等水平顯著上升（P<0.01），而HDL-C則顯著下降（P<0.01）;與模型組比較，模型+雙胍+中藥組和模型+雙胍+卡托普利組的FBG、TG、TC、LDL-C等水平顯著下降（P<0.01），而HDL-C水平則無(wú)顯著變化。見(jiàn)表1。

2.1.2 各組大鼠腎臟相關(guān)指標(biāo)的比較 與正常組比較，模型組大鼠的Scr、BUN、24 h UTP、24 h mALB等水平顯著上升（P<0.01）;與模型組比較，模型+雙胍+中藥組和模型+雙胍+卡托普利組的Scr、BUN、24 h UTP、24 h mALB等水平顯著上升（P<0.01）。見(jiàn)表2。

2.2 大鼠腎皮質(zhì)HE染色、PAS染色、Masson染色結(jié)果 1）HE染色主要看組織結(jié)構(gòu)的完整性以及病理情況，其結(jié)果顯示：正常組腎組織結(jié)構(gòu)排列緊密，腎小球、腎小管形體結(jié)構(gòu)正常;模型組腎臟病變明顯，腎小球基底膜增厚，胞外基質(zhì)、系膜基質(zhì)積聚。各給藥組（DN+Met+ZY、DN+Met+Cap）較模型組病理變化有所改善，給藥各組之間變化不明顯。2）Masson染色主要看組織發(fā)生纖維化程度，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色，其結(jié)果顯示：正常組腎組織中無(wú)明顯藍(lán)色，即存在極少量的膠原纖維。模型組存在較多膠原纖維，說(shuō)明DN促使腎組織發(fā)生纖維化。各給藥組（DN+Met+ZY、DN+Met+Cap）腎組織的膠原纖維較模型組少，給藥組之間腎組織膠原纖維表達(dá)無(wú)差別。3）PAS染色是觀察腎臟結(jié)構(gòu)，尤其是腎小球系膜、基底膜以及腎小管結(jié)構(gòu)的主要方法，紫紅色深淺代表糖原或多糖的含量高低，其結(jié)果顯示：模型組腎組織多糖和糖原表達(dá)比正常組表達(dá)明顯增加，呈紫紅色。各給藥組（DN+Met+ZY、DN+Met+Cap）腎組織多糖或糖原的表達(dá)均比模型組表達(dá)量減少，給藥組之間腎組織多糖或糖原的表達(dá)相近。綜上所述，DN大鼠模型造模成功，模型+二甲雙胍+中藥組、模型+二甲雙胍+卡托普利組均能改善腎組織病理變化，且二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

2.3 大鼠腎小球超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察結(jié)果 電鏡結(jié)果顯示，正常組大鼠腎組織中腎小球毛細(xì)血管基底膜厚度平均為138.8 nm，足細(xì)胞排列整齊。模型組大鼠腎小球基底膜均勻增厚，其最大值達(dá)354.26 nm，平均值為284.43 nm，約為正常組基底膜平均值的2倍。模型組腎足細(xì)胞發(fā)生融合，無(wú)電子致密物質(zhì)沉積。與模型組比較，各給藥組（DN+Met+ZY、DN+Met+Cap）大鼠的腎小球基底膜厚度均勻降低，足細(xì)胞融合度明顯減少。見(jiàn)表3，圖2～3。

2.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)及生信分析結(jié)果

2.4.1 表達(dá)差異分析 模型組與正常組比較，轉(zhuǎn)錄本中共計(jì)13 345基因，其中可以找到6 626個(gè)顯著上調(diào)基因，6 719個(gè)顯著下調(diào)基因;模型+二甲雙胍+中藥組對(duì)比模型組，轉(zhuǎn)錄本中共計(jì)13 316個(gè)基因，其中可以找到6 480個(gè)顯著上調(diào)基因，6 836個(gè)顯著下調(diào)基因。見(jiàn)圖4～5。

2.4.2 差異表達(dá)最為明顯的雙向調(diào)控基因 篩選出同時(shí)滿(mǎn)足模型組對(duì)比正常組下調(diào)而模型+二甲雙胍+中藥組對(duì)比模型組上調(diào)的差異表達(dá)最為明顯的雙向調(diào)控基因共計(jì)6個(gè)，同時(shí)滿(mǎn)足模型組對(duì)比正常組上調(diào)而模型+二甲雙胍+中藥組對(duì)比模型組下調(diào)的差異表達(dá)最為明顯的雙向調(diào)控基因共計(jì)4個(gè)。見(jiàn)圖6～7。

2.4.3 差異表達(dá)基因GO富集分析結(jié)果 模型組對(duì)比正常組差異表達(dá)基因主要注釋到生物學(xué)過(guò)程類(lèi)別，包括細(xì)胞過(guò)程、單生物體過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、代謝途徑、刺激應(yīng)答、多細(xì)胞生物體過(guò)程等;細(xì)胞組分類(lèi)別主要包括細(xì)胞、細(xì)胞組成、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、膜組成、細(xì)胞器組成、胞外基質(zhì)、胞外基質(zhì)組成、大分子復(fù)合物等;分子功能主要包括結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、分子功能調(diào)節(jié)子、分子轉(zhuǎn)化活性、信號(hào)轉(zhuǎn)化活性等。見(jiàn)圖8。模型+二甲雙胍+中藥組對(duì)比模型組差異表達(dá)基因主要注釋到生物學(xué)過(guò)程類(lèi)別，包括單生物體過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、刺激應(yīng)答、代謝途徑、多細(xì)胞生物體過(guò)程、定位等;細(xì)胞組分類(lèi)別主要包括細(xì)胞、細(xì)胞組成、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、膜組成、胞外基質(zhì)、胞外基質(zhì)組成、細(xì)胞器組成、大分子復(fù)合物等;分子功能主要包括結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、分子功能調(diào)節(jié)子、信號(hào)轉(zhuǎn)化活性、分子轉(zhuǎn)化活性等。見(jiàn)圖9。

2.4.4 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析結(jié)果 ? 模型組對(duì)比正常組差異表達(dá)基因顯著富集的前20條信號(hào)通路有丙肝、甲流、色氨酸代謝、RIG-1樣受體信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等。見(jiàn)圖10。模型+二甲雙胍+中藥組對(duì)比模型組差異表達(dá)基因顯著富集的前20條信號(hào)通路有代謝相關(guān)通路（超過(guò)20個(gè)基因）、cAMP信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路等。見(jiàn)圖11。

3 討論

本觀察組前期研究發(fā)現(xiàn)活血降糖飲不僅能有效地改善胰島素抵抗，增加胰島素敏感性，調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂，減少蛋白尿，延緩腎功能下降[7-9]。而本次基礎(chǔ)研究也表明其不僅能降低血糖、血脂，亦能減少尿蛋白及尿微量白蛋白排泄量;此外，HE染色、Masson染色、PAS染色均提示模型組中腎組織發(fā)生了明顯的病理變化，而給藥組能有效改善，電鏡結(jié)果提示DN大鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜均勻增厚，腎足細(xì)胞發(fā)生融合，而給藥組能改善腎小球GBM和系膜細(xì)胞功能，進(jìn)一步說(shuō)明了活血降糖飲能通過(guò)改善腎組織結(jié)構(gòu)功能、減輕足細(xì)胞損傷、減少腎組織纖維化程度以及糖原或多糖含量，從而延緩DN進(jìn)展，與前期研究結(jié)果一致。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還選取了正常組、模型組、模型+雙胍+中藥組的大鼠腎皮質(zhì)組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究，進(jìn)一步探尋活血降糖飲治療DN的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。結(jié)果表明，模型組對(duì)比正常組與模型+二甲雙胍+中藥組對(duì)比模型組轉(zhuǎn)錄本中基因總量接近，模型組對(duì)比正常組上調(diào)或下調(diào)基因量與模型+二甲雙胍+中藥組對(duì)比模型組下調(diào)或上調(diào)基因量接近，其中篩選出差異最明顯的反向調(diào)控基因10個(gè)。根據(jù)GO富集分析，模型組對(duì)比正常組與模型+二甲雙胍+中藥組對(duì)比模型組差異表達(dá)基因均主要注釋到生物學(xué)過(guò)程類(lèi)別，包括細(xì)胞過(guò)程、單生物體過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、代謝途徑等。KEGG前20條顯著富集通路分析顯示模型組對(duì)比正常組與模型+二甲雙胍+中藥組對(duì)比模型組共同作用的信號(hào)通路有代謝相關(guān)通路及cAMP信號(hào)通路。

Cftr即囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子，是一種環(huán)磷酸腺苷（cAMP）依賴(lài)的跨膜氯離子通道蛋白，存在于多種組織、器官如呼吸道、消化道、生殖道、汗腺等的上皮細(xì)胞頂側(cè)膜，在上皮液體分泌過(guò)程中具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)Cftr在糖尿病胰島B細(xì)胞中低表達(dá)是β細(xì)胞胰島素分泌減少和功能受損的一個(gè)重要因素[12]，其參與調(diào)控β細(xì)胞分泌功能，并通過(guò)此功能參與調(diào)節(jié)胰島損傷。Cftr激活途徑有2條：cAMP依賴(lài)的PKA途徑及效應(yīng)劑直接與蛋白質(zhì)作用從而改變CFTR的構(gòu)象。當(dāng)cAMP濃度升高時(shí)，CFTR蛋白構(gòu)型改變、通道開(kāi)放、氯離子外流。陰離子的主動(dòng)運(yùn)輸促使陽(yáng)離子分泌，進(jìn)而導(dǎo)致水沿著滲透梯度排放，在維持人體電解質(zhì)的平衡和內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)活血降糖飲能增加糖、脂毒性導(dǎo)致的受損胰島素細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，cAMP濃度增加并激活蛋白激酶A（Protein Kinase A，PKA），通過(guò)cAMP/PKA激酶通路增強(qiáng)β細(xì)胞內(nèi)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并提高對(duì)葡萄糖刺激信號(hào)的敏感性，從而增加胰島素分泌量[13]。本研究結(jié)果顯示CFTR跨膜離子通道在模型組對(duì)比正常組表達(dá)明顯降低，而在模型+二甲雙胍+中藥組對(duì)比模型組表達(dá)明顯升高，表明活血降糖飲治療DN可能是通過(guò)作用于cAMP/PKA通路上調(diào)Cftr從而改善胰島細(xì)胞功能降低血糖實(shí)現(xiàn)的。

丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（PDC）可以催化線(xiàn)粒體中丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，是葡萄糖氧化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶。丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）磷酸化PDC從而抑制其活性。Pdk4即丙酮酸脫氫酶激酶4，是PDK同工酶中的一種，在骨骼肌、肝臟、腎臟等具有高度的脂肪酸氧化能力，是PDC調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的中心，是丙酮酸氧化和葡萄糖維持體內(nèi)平衡的關(guān)鍵酶[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，PDK4表達(dá)上調(diào)可使葡萄糖向脂肪酸轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)胰島素抵抗，加速血糖升高和糖尿病病情的進(jìn)展[16]，而抑制Pdk4表達(dá)可提高PDC活性，從而促進(jìn)葡萄糖氧化，抑制無(wú)氧糖酵解和脂肪酸氧[17]，改善胰島素抵抗[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組對(duì)比正常組中Pdk4明顯上調(diào)，而在模型+二甲雙胍+中藥組對(duì)比模型組明顯下調(diào)，提示Pdk4高表達(dá)降低了葡萄糖氧化水平，減少了組織對(duì)葡萄糖的攝取從而升高了血糖，而活血降糖飲可顯著下調(diào)Pdk4，可能與其能提高PDC活性，調(diào)節(jié)葡萄糖代謝及改善胰島素抵抗有關(guān)。

Angptl4即血管生成素樣蛋白4，是一種參與糖和脂質(zhì)代謝的分泌型蛋白，與糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗有密切關(guān)系[19]。其作用主要體現(xiàn)在氧化代謝、血管發(fā)生創(chuàng)傷、修復(fù)及腫瘤轉(zhuǎn)移等方面。有研究發(fā)現(xiàn)，Angptl4可以損傷足細(xì)胞，致使機(jī)體發(fā)生腎小球病變進(jìn)而產(chǎn)生大量蛋白尿，而在足細(xì)胞相關(guān)腎病中，也發(fā)現(xiàn)腎小球足細(xì)胞分泌的Angptl4表達(dá)增加[20-21]。本研究也發(fā)現(xiàn)模型組腎小球毛細(xì)血管基底膜均勻增厚，腎足細(xì)胞發(fā)生融合，模型組對(duì)比正常組Angptl4明顯上調(diào)，而經(jīng)活血降糖飲治療后腎小球基底膜厚度均勻降低，足細(xì)胞融合度明顯減少，且模型+二甲雙胍+中藥組對(duì)比模型組Angptl4明顯下調(diào)，證明活血降糖飲可能是通過(guò)抑制Angptl4的表達(dá)，從而改善足細(xì)胞的損傷，減少蛋白尿，以緩解糖尿病的進(jìn)展。

Hmgcs2即3羥3甲基戊二酰輔酶A合酶2，是合成酮體的限速酶，其代謝產(chǎn)物酮體會(huì)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化及炎癥介質(zhì)表達(dá)增加。有研究證實(shí)，腎小管損傷是DN的早期特征，腎小管病變可通過(guò)管球反射引起高濾過(guò)，從而導(dǎo)致腎小球的病變[22-23]。楊慧[23]研究發(fā)現(xiàn)，不論是糖尿病實(shí)驗(yàn)鼠還是糖尿病患者的腎臟組織，Hmgcs2主要在表達(dá)在腎小管中。高血糖會(huì)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞Hmgcs2表達(dá)增加，從而導(dǎo)致酮體合成增加，而酮體主要在近端腎小管被重吸收，會(huì)直接誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及炎癥介質(zhì)表達(dá)增加，從而加重腎小管的損傷，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生發(fā)展;此外，酮體還會(huì)刺激氧自由基的產(chǎn)生并導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，而此會(huì)導(dǎo)致糖尿病血管疾病的發(fā)生[24-27]。在本研究中，模型組對(duì)比正常組Hmgcs2明顯上調(diào)，提示Hmgcs2是DN的潛在靶向基因，與目前關(guān)于Hmgcs2介導(dǎo)DN發(fā)生發(fā)展的研究結(jié)果相呼應(yīng);而模型+二甲雙胍+中藥組對(duì)比模型組Hmgcs2明顯下調(diào)，提示活血降糖飲可能通過(guò)下調(diào)DN腎小管中Hmgcs2的表達(dá)，減少酮體的生成從而保護(hù)腎臟以延緩DN進(jìn)展。

其他差異表達(dá)較為明顯的反向調(diào)控基因LOC361914、Slc7a12、Gpa33、Prss35、Atp1a4、Atp12a在目前尚未發(fā)現(xiàn)與糖尿病及DN相關(guān)的作用機(jī)制研究，后期可立足于這些靶向基因進(jìn)行進(jìn)一步分子機(jī)制研究，為DN的防治提供有效途徑和新的藥物。

綜上所述，活血降糖飲聯(lián)合二甲雙胍能降低血糖、血脂，減少尿蛋白及尿微量白蛋白排泄量，改善腎功能，同時(shí)還能改善DN的腎臟病理改變。中醫(yī)學(xué)治療疾病常以多靶點(diǎn)、多途徑進(jìn)行全面調(diào)節(jié)以及個(gè)體化治療方案為特點(diǎn)。本研究表明活血降糖飲治療DN可能是通過(guò)多靶點(diǎn)，多途徑實(shí)現(xiàn)的。其對(duì)DN的防治作用主要體現(xiàn)在改善胰島細(xì)胞功能、調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、減輕腎小球足細(xì)胞損傷及腎小管損傷，而這些雙向調(diào)控的靶向基因是通過(guò)哪些通路以及具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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（2019-09-03收稿 責(zé)任編輯：王明）