馬蓉，劉宏，鄭如文，許招懂，江志強，張俊華，蔣研風羊，畢聰

(廣州白云山光華制藥股份有限公司,廣東 廣州 510285)

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，在2020年新型冠狀病毒肺炎防治過程中，彰顯了獨特的優(yōu)勢[1]。但隨著現(xiàn)代醫(yī)學的不斷進步，中醫(yī)藥面臨著機遇與挑戰(zhàn)。利用先進技術(shù)手段闡明其內(nèi)在科學規(guī)律，實現(xiàn)其現(xiàn)代化；為其賦予全新思路，讓經(jīng)典名方煥發(fā)新活力，成了當前研究的熱點。網(wǎng)絡藥理學使藥物研究擺脫單成分單靶點的束縛，從整體網(wǎng)絡角度解讀多藥味中藥與細胞、組織、器官的相互關系，加速了中成藥機制解析與新藥研發(fā)[2]。由于其是計算機預測的結(jié)果，需結(jié)合實驗進行驗證。

小柴胡顆粒是廣州白云山光華制藥股份有限公司生產(chǎn)的名優(yōu)中藥大品種[3]，源于醫(yī)圣張仲景《傷寒雜病論》中名方“小柴胡湯”，由柴胡、黃芩、姜半夏、黨參、生姜、甘草、大棗七味中藥組成，具有解表散熱，疏肝和胃的功效[4]。小柴胡湯在治療感冒、流感及各種變異流感等傷寒疫癥方面療效顯著，發(fā)熱是其應用最廣泛的適應證，但其作用機制尚不確定。因此本研究結(jié)合指紋圖譜液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、網(wǎng)絡藥理學技術(shù)和動物實驗，構(gòu)建小柴胡顆粒退熱靶點數(shù)據(jù)庫，并建立干酵母致熱大鼠模型，結(jié)合發(fā)熱機理對其中關鍵靶點進行確證，明確小柴胡顆粒發(fā)揮退熱療效的作用機制，為其科學內(nèi)涵的解析及臨床應用提供依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 實驗材料 儀器：島津LC-30A超高效液相色譜儀；美國AB SCIEX公司四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀(Triple Q-TOF 5600+)；純水儀(Millipore)；動物電子秤(G&G)；超低溫冰箱(Thermo Scientific)；電子分析天平(Sartorius)；渦旋混合儀(其林貝爾)；電子體溫計(歐姆龍)；酶標儀(ThermoFisher)。

試藥與試劑：小柴胡顆粒(廣州白云山光華制藥股份有限公司)；阿司匹林腸溶片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；肝素鈉(Sigma-aldrich)；水合氯醛(阿拉丁)；PBS(pH 7.4，Hyclone)；干酵母(安琪)；PTGS2試劑盒(Biomatik)；AP-1試劑盒(BioSource)；白細胞介素-1β(IL-1β)、干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、核因子κB(NF-κB)試劑盒(R&D)。

實驗動物：48只10周齡雄性，SPF級SD大鼠，由青龍山動物繁殖中心提供，許可證號：SCXK(蘇)2017-0001。大鼠專用顆粒飼料(江蘇協(xié)同生物有限公司)飼喂，飼養(yǎng)于SPF級動物房。12 h/12 h光照/黑暗循環(huán)，自由攝食飲水，溫度維持20～26 ℃，相對濕度40%～70%。

1.2 化學成分定性解析 供試品制備：取小柴胡顆粒提取液，1 300 r·min-1離心10 min，0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣。

色譜條件：C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱；柱溫40 ℃；流速0.25 mL·min-1；進樣量1 μL；流動相乙腈-0.1%甲酸水的梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：電噴霧正、負離子模式掃描；離子源電壓：5 500V、-4 500V；離子源溫度：600 ℃、500 ℃；去簇電壓(DP)：100 V、100 V；碰撞能量(CE)：35 eV、-35 eV；碰撞能量擴展(CES)：15 eV、15 eV；霧化輔助氣1為60 PSI，輔助氣2為50 PSI，氣簾氣為40 PSI。

1.3 小柴胡顆粒靶點獲取及分類 利用PubChem數(shù)據(jù)庫獲取小柴胡顆?；瘜W成分的結(jié)構(gòu)，通過Swiss數(shù)據(jù)庫預測各化合物的作用靶點[5]，并采用chEMBL數(shù)據(jù)庫對靶點進行分類[6]。

1.4 發(fā)熱疾病靶點獲取 通過GeneCard[7]數(shù)據(jù)庫、DisGeNET[8]數(shù)據(jù)庫檢索人類發(fā)熱(Fever)相關靶點[9]，分別選擇兩個數(shù)據(jù)庫Relevance score≥5.9和score≥0.3的靶點，作為發(fā)熱靶點。采用Bioinformatics & Evolutionary對小柴胡顆粒作用靶點與發(fā)熱靶點取交集，獲得小柴胡顆粒退熱潛在作用靶點。

1.5 核心靶點篩選 通過STRING平臺分析小柴胡顆粒退熱潛在作用靶蛋白相互作用，并利用Cytoscape3.7.0可視化網(wǎng)絡并采用cytohubba插件篩選核心靶點。

1.6 干酵母致熱模型大鼠的實驗驗證 48只大鼠隨機分為6組，分別為空白組、模型組、陽性藥阿司匹林組(0.081 g·kg-1)、小柴胡顆粒低劑量組(5.4 g·kg-1，臨床劑量)、中劑量組(10.80 g·kg-1)、高劑量組(21.60 g·kg-1)。大鼠適應性生長7 d。小柴胡顆粒組每天灌胃給藥1次，連續(xù)7 d，阿司匹林組第7天一次性灌胃給藥。末次給藥前1 h內(nèi)測大鼠肛溫2次，取其均值作為基礎體溫，其中體溫大于38.3 ℃或連續(xù)兩次體溫差值大于0.5 ℃的動物淘汰。末次給藥后除空白組外，其余組按2 mL/100 g皮下注射10%干酵母混懸液[10]，空白組注射等量生理鹽水，構(gòu)建發(fā)熱模型。造模后0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h測量肛溫。10 h時大鼠眼眶取血，采用ELISA方法檢測血清NF-κB、PTGS2、AP-1、IL-1β、IFN-γ、IL-6、TNF-α。

2 結(jié)果

2.1 化學成分分析 基于超高效液相色譜-質(zhì)譜(UHPLC-MS)技術(shù)對小柴胡顆?；瘜W成分進行分離、鑒定。通過正、負離子模式掃描，得到總離子流圖(見圖1)。通過搜索數(shù)據(jù)庫、分析裂解碎片等方法，共指證到小柴胡顆粒中的66個化合物(見表2)。

A.正離子模式;B.負離子模式圖1 小柴胡顆粒與空白樣品總離子流圖

表2 小柴胡顆?；瘜W成分分析

表2(續(xù))

2.2 基于網(wǎng)絡藥理學的靶點預測

2.2.1 小柴胡顆粒靶點獲取及分類 小柴胡顆粒的66個成分在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中共篩選得到691個潛在作用靶點，通過chEMBL數(shù)據(jù)庫對靶點進行分類，成分-靶點-靶點分類網(wǎng)絡見圖2。結(jié)果顯示，小柴胡顆粒的靶點主要為酶類、離子通道類、膜受體類、分泌蛋白類、轉(zhuǎn)錄因子類等類別，其中數(shù)量最多的為酶類，包括激酶、蛋白酶、氧化還原酶、磷酸酶等。

圖2 小柴胡顆粒成分-靶點-分類網(wǎng)絡圖

2.2.2 小柴胡顆粒退熱靶點篩選 基于GeneCard、DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲得發(fā)熱相關靶點332個，與小柴胡顆粒潛在作用靶點取交集，得到小柴胡顆粒發(fā)揮退熱作用的靶點68個(見圖3)。

圖3 小柴胡顆粒發(fā)揮退熱作用的靶點庫

2.2.3 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建 將小柴胡顆粒發(fā)揮退熱作用的68個作用靶點導入String數(shù)據(jù)庫，獲取TSV格式，采用Cytoscape軟件將PPI網(wǎng)絡圖可視化并計算核心基因(見圖4)。結(jié)果顯示，在蛋白互作網(wǎng)絡中排名前十的基因分別為VEGFA、TNF、CCL2、CXCL8、IL-6、PTGS2、IFNG、IL-10、ICAM1和IL-1β，結(jié)果提示這些靶點可能是小柴胡顆粒發(fā)揮解表散熱作用的關鍵靶點。

圖4 小柴胡顆粒退熱靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡圖(PPI)及核心基因篩選

2.3 基于干酵母致熱大鼠模型的靶點驗證

2.3.1 體溫監(jiān)測結(jié)果 體溫監(jiān)測結(jié)果與體溫增長曲線顯示(見圖5)，與空白組相比，模型組大鼠在造模2 h后各個監(jiān)測點體溫均極顯著升高(P<0.01)，8 h后達到峰值，此后體溫略有下降。模型組大鼠體溫出現(xiàn)了上升期、高峰期和下降期，這與酵母致熱的特點相符合，表明模型建立成功。與模型組相比，在觀察時間范圍內(nèi)(4～24 h)，陽性藥阿司匹林組大鼠的體溫顯著降低(4～24 h)(P<0.01)；與模型組相比，在觀察時間范圍內(nèi)(4～24 h)，小柴胡顆粒給藥組在各個觀測點的體溫均出現(xiàn)顯著下降(低劑量組P<0.05，中、高劑量組P<0.01)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。結(jié)果表明，小柴胡顆粒對酵母致熱大鼠上升期、高峰期和下降期的體溫均有顯著降低作用，具有良好的退熱療效。小柴胡顆粒組在造模后12 h 體溫開始降低后，可維持體溫持續(xù)下降，且24 h內(nèi)不反彈。此外，小柴胡顆粒中、高劑量的降溫能力與阿司匹林相當。

圖5 各實驗組大鼠的體溫動態(tài)監(jiān)測曲線

2.3.2 上游基因表達水平 結(jié)果表明(見圖6)，與空白組相比，模型組大鼠的NF-κB、AP-1均顯著升高(P<0.05)；小柴胡顆粒和阿司匹林組大鼠的NF-κB、AP-1水平呈下降趨勢，但與模型組相比沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

圖6 各實驗組大鼠血清中的NF-κB、AP-1含量 注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01(n=8)

2.3.3 內(nèi)生致熱原表達水平 結(jié)果表明(見圖7)，與空白組相比，模型組大鼠的TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-1β均極顯著升高(P<0.05)，表明酵母致熱大鼠的內(nèi)生致熱原水平上升，同時伴有過度炎癥反應；陽性藥組大鼠的TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-1β含量均明顯低于模型組大鼠(P<0.01)，表明阿司匹林可極顯著降低內(nèi)生致熱原水平，從而降低體溫，這與已有文獻研究一致；與模型組相比，小柴胡顆粒低劑量組可顯著降低TNF-α、IL-6、IL-1β水平(P<0.05，P<0.01)；小柴胡顆粒中、高劑量組可顯著降低TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-1β 水平(P<0.05，P<0.01)，表明小柴胡顆粒可能通過降低內(nèi)生致熱原TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-1β的含量，從而降低體溫調(diào)定點，發(fā)揮退熱作用，且中、高劑量與阿司匹林作用相當。

圖7 各實驗組大鼠血清中的IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α含量 注：與空白組比較，#P<0.05 ，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05 ，**P<0.01(n=8)

2.3.4 環(huán)氧合酶2(PTGS2)表達水平 結(jié)果顯示(見圖8)，與空白組相比，模型組大鼠的PTGS2顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，阿司匹林可顯著降低PTGS2水平(P<0.05)，小柴胡顆粒低、中劑量可顯著降低 PTGS2水平(P<0.01)，從而抑制發(fā)熱介質(zhì)的釋放，直接調(diào)控體溫。

圖8 各實驗組大鼠血清中的PTGS2含量 注：與空白組比較，#P<0.05 ，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01(n=8)

3 討論

發(fā)熱是指各種病原體如細菌、病毒、寄生蟲等入侵機體后，通過NF-κB、AP-1等上游通路激活了致熱原細胞，使其釋放IL-1等內(nèi)生致熱原，進一步促進環(huán)氧合酶產(chǎn)生PGE2等發(fā)熱介質(zhì)，引起機體體溫升高[11]。研究表明，NF-κB在病原體誘導的宿主炎癥反應中發(fā)揮核心作用[12]，AP-1則參與體內(nèi)免疫系統(tǒng)調(diào)控，在信號級聯(lián)反應與物質(zhì)轉(zhuǎn)運中[13]發(fā)揮重要作用。內(nèi)生致熱原則是在刺激下被釋放的致熱物質(zhì)，可直接或間接作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，引起體溫升高[14]。目前已被證實的內(nèi)生致熱原有IL-1、IL-6、TNF、IFN和MIP-1。下游的PTGS2是發(fā)熱介質(zhì)PGE2合成的主要限速酶，直接參與發(fā)熱、疼痛反應[15]。

源于《傷寒論》首方的小柴胡顆粒具有顯著的解熱抗炎療效，且在臨床中有廣泛的應用。陳瑛[16]研究發(fā)現(xiàn)小柴顆粒治療上呼吸道感染可顯著降低退熱起效時間與完全退熱時間；趙望森等[17]發(fā)現(xiàn)小柴胡顆粒配合奧司他韋可以顯著縮短患兒發(fā)熱、咳嗽等癥狀的緩解時間；小柴胡顆粒在治療經(jīng)行發(fā)熱[18-19]、瘧疾[20]等疾病時同樣可以顯著降低患者體溫，提高治療有效率。有鑒于此，本研究采用化學成分分析、計算機預測靶點與動物實驗驗證相結(jié)合方式，明確小柴胡顆粒發(fā)揮退熱療效的作用機制。研究篩選出68個小柴胡顆粒退熱的潛在作用靶點，基于發(fā)熱癥狀的發(fā)展病程，對其中7個關鍵靶點進行驗證。建立干酵母致熱大鼠模型，結(jié)果表明，小柴胡顆粒對酵母致熱大鼠上升期、高峰期和下降期的體溫均有顯著降低作用，且可維持體溫24 h不反彈，退熱機制關聯(lián)機體發(fā)熱的多個環(huán)節(jié)，可能與降低機體炎癥水平、抑制內(nèi)生致熱原和發(fā)熱介質(zhì)PGE2合成的主要限速酶環(huán)氧合酶2有關。本研究運用多種現(xiàn)代技術(shù)，闡明了經(jīng)典名方小柴胡顆粒退熱的分子機制，為其在當代臨床的應用提供了有力的證據(jù)，也為其進一步的開發(fā)利用奠定了基礎。