姚芳,王曉睛,李松霖,鄭夢如,梁錦霞,謝芳

壞死性小腸結腸炎(necrotizing enterocolitis, NEC) 是新生早產兒最常見的后天獲得性腸道危重急癥，其特征為腸黏膜甚至為腸深層的壞死。與NEC相關的總體死亡率約為20%～30%，其確切的發(fā)病機制仍不清楚[1]。目前研究認為NEC的發(fā)生主要與腸道發(fā)育不成熟、持續(xù)的腸道缺血、配方喂養(yǎng)及微生物定植等多種因素有關[2-3]。腸道屏障的通透性主要是由上皮細胞周圍的緊密連接介導的，其功能破壞已被證明是腸道炎癥發(fā)生的重要因素[4-5]。在NEC的小鼠及患兒手術標本中，跨膜緊密連接蛋白claudin-2表達明顯升高，而occludin、 claudin-4 和claudin-7蛋白表達水平下降且分布發(fā)生內化，使腸道的通透性增加從而促進NEC的發(fā)生[6-8]。因此，能夠逆轉緊密連接蛋白和腸黏膜屏障功能的策略或干預措施對預防NEC至關重要。

多不飽和脂肪酸是指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長度為18～22個碳原子的直鏈脂肪酸，包括n-3和n-6多不飽和脂肪酸兩類。n-3多不飽和脂肪酸主要包括亞麻酸(α-linolenic acid)，EPA(eicosapen-taenoicacidacid)及DHA (docosahexaenoic acid)，體內亞麻酸可部分轉換為EPA和DHA，在妊娠期間該轉換效率會升高[9]。這類多不飽和脂肪酸具有重要的生理功能，如促進胎兒及嬰幼兒大腦生長發(fā)育、維持正常視力、抗血栓、抗腫瘤等方面[10-12]。近年大量研究還發(fā)現n-3多不飽和脂肪酸對保護腸黏膜屏障完整性發(fā)揮重要作用。在大鼠缺血性休克模型中，飼喂魚油可明顯緩解炎癥反應，提高大鼠 Chiu′s 評分，保護腸黏膜絨毛及緊密連接完整性[13]。在IL-10敲除小鼠誘導的實驗性結腸炎模型中，DHA通過恢復occludin和ZO-1表達及細胞膜的分布，維持正常的腸黏膜屏障功能，從而緩解結腸炎癥狀[14]。然而，n-3多不飽和脂肪酸是否在NEC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用尚不完全清楚。因此，本文主要探討n-3多不飽和脂肪酸是否通過調節(jié)緊密連接蛋白的表達與分布修復損傷的腸黏膜屏障功能，從而緩解NEC的相關癥狀及降低疾病發(fā)生率，以期為臨床防治NEC提供思路和潛在靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要試劑

66只SPF級新生3 d的C57BL/6J乳鼠，體重1.92～2.86 g,購自廣州中醫(yī)藥大學動物中心(動物許可證號：SCXK(粵)2013-0034)；Similac Advance infant formula (Abbott Nutrition): Esbilac canine milk replacer, 2∶1；RIPA buffer(cell signaling technology貨號：9806)、ZO-1 抗體(Santa cruz貨號：9806)、claudin-4抗體(Santa cruz貨號：sc-376643); claudin-7抗體(Abcam貨號：ab27487)；一步法逆轉錄試劑盒Maxima First Strand Synthesis Kit(Thermo Fisher scientific貨號：K1671)、Mem-PERTM Plus Membrane Protein Extraction Kit(Thermo Fisher scientific貨號：89842)；SYBR Green PCR master mix(Thermo Fisher scientific貨號：4309155)，高糖DMEM、胎牛血清、細胞培養(yǎng)耗材購自康寧，DHA(Cayman Chemical貨號：90310)； IL-1 beta/IL-1F2 Quantikine ELISA Kit試劑盒(R&D Systems貨號：RLB00); TNF-alpha Quantikine ELISA Kit(R&D Systems貨號：RTA00)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的制備 將新生乳鼠隨機分為3組(n=10)：第一組為母乳喂養(yǎng)組(DF組)，生后一直由母鼠進行喂養(yǎng)，不作其他處理；第二組為NEC組，利用缺氧冷刺激+人工喂養(yǎng)方式建立NEC模型；第三組為NEC+n-3多不飽和脂肪酸補充組(n-3組)，在建立NEC模型的基礎上，給予口服9 mL·kg-1·d-1魚油進行n-3多不飽和脂肪酸補充。參考相應文獻構建NEC模型[15]，方法為：乳鼠生后第3天與母鼠分離，置于保育箱內，經口進行人工配方奶灌胃喂養(yǎng)。每次灌胃量為40 μL/g，每隔4 h灌胃一次，每天5次，一共4 d。在每天第二次與第四次灌胃后，將乳鼠放入缺氧箱內，以5 L/min流量充入95%氮氣與5%氧氣的混合氣體，缺氧10 min，之后取出乳鼠。待乳鼠恢復后(約5 min)，再將乳鼠放置于4 ℃冰箱中進行冷刺激10 min后放回保育箱。所有乳鼠在生后第7天處死，取腸道組織標本進行相關實驗。

1.2.2 乳鼠一般情況觀察 所有乳鼠每天上午在人工配方奶灌胃前進行體重測定，同時觀察其呼吸、膚色的改變、有無明顯的腹脹以及腹瀉等臨床癥狀，進行記錄。

1.2.3 腸組織病理學形態(tài)觀察及NEC評分 4%多聚甲醛PBS溶液固定小腸組織，脫水、透明、石蠟包埋、切片4 μm，行常規(guī)HE染色。參照相應文獻[16]進行NEC病理評分標準：0分(正常)，沒有損傷；1分(輕度)，黏膜下層和/或固有層輕微分離；2分(中度)，黏膜下層和/或固有中度分離和/或黏膜下層和肌層水腫；3分(嚴重)，黏膜下層和/或固有嚴重分離或黏膜下層和肌層嚴重水腫，同時伴有局部絨毛缺失；4分(壞死)，絨毛缺失并且壞死。小鼠NEC發(fā)生的標準：組織學評分≥2分。

1.2.4 采用Werstern blotting(WB)方法和實時熒光定量PCR(qRT-QPCR)方法分別檢測蛋白及基因的表達 將取材后乳鼠腸道組織或培養(yǎng)的CaCo2細胞在含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中勻漿，低溫離心吸取上清液測蛋白濃度。 SDS-PAGE分離蛋白質，經轉膜，孵育相應一抗、二抗，化學發(fā)光顯影觀察結果。提取乳鼠腸組織中總RNA，隨之使用Maxima First Strand Synthesis Kit將1 μg總RNA逆轉錄合成cDNA。采用SYBR Green PCR master mix通過 羅氏LC480儀器進行定量PCR，擴增40個循環(huán)。使用的引物序列如下：ZO-1 forward: 5′-AGGACACCAAAGCATGTGAG-3′；ZO-1 reverse: 5′-GGCATTCCTGCTGGTTACA-3′；Claudin-4 forward: 5′-CGCTACTCTTGCCATTACG-3′； Claudin-4 reverse: 5′-ACTC-AGCACACCATGACTTG-3′；Claudin-7 forward: 5′-AGGGTCT-GCTCTGGTCCTT-3′;Claudin-7 reverse: 5′-GTACGCAGCTTT-GCTTTCA-3′。

1.2.5 CaCo2細胞系培養(yǎng)及模型構建 由于CaCo2細胞系是用于體外研究腸道上皮細胞緊密連接模型的常用細胞，因此我們用此細胞系建立NEC炎癥模型。CaCo2購自上海細胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，2～3 d進行細胞換液或傳代。體外NEC細胞模型采用LPS(5 μg/mL)進行誘導。DHA溶于DMSO中配置成合適的濃度(50 nM)保存于-80 ℃，后續(xù)利用培養(yǎng)基稀釋成不同工作濃度對細胞進行處理。

1.2.6 細胞膜蛋白及漿蛋白分離提取 刮取細胞，300 g離心5 min，收集細胞，3 mL Cell Wash Solution重懸細胞，300 g離心5 min，棄上清，1.5 mL Cell Wash Solution重懸細胞，300 g離心5 min，棄上清，加0.75 mL Permeabilization Buffer于細胞沉淀，渦旋，4 ℃混勻10 min，16 000 g 離心15 min，收集上清(此為胞漿蛋白)，沉淀加入0.5 mL Solubilization Buffer，重懸，4 ℃混勻30 min，4 ℃ 16 000g離心15 min，收集上清(此為可溶性的胞膜蛋白及膜相關蛋白)。利用WB方法檢測樣品中相關蛋白的表達水平。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠的一般狀況及體重變化

進行NEC造模前，各組乳鼠的平均體重沒有明顯差異(P>0.05)。造模第2天后，NEC組出現明顯的腹脹、腹瀉及便血等消化道癥狀，此外還有呼吸急促、對外界的刺激反應遲鈍，皮膚顏色變暗等癥狀的改變；而n-3組腹脹程度較輕，腹瀉次數較少，便血程度相對較輕，消化道及其他癥狀均較NEC組好。造模完成后，NEC組乳鼠體重增長比對照組低(P<0.05)，而n-3組與對照組相比沒有明顯差異(P>0.05)。此外，與對照組相比，NEC組乳鼠死亡較多，存活率僅為68.18%；而n-3組乳鼠死亡減少，存活率可達81.82%，明顯高于NEC組，差異具有與統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 乳鼠NEC造模前后的體重及存活率的變化

2.2 n-3多不飽和脂肪酸能明顯減輕NEC的癥狀，降低NEC發(fā)生率

造模7 d后，取乳鼠全腸組織進行大體觀察，可見對照組腸組織彈性良好，無明顯充血及充氣征；NEC組回腸部分則明顯充血紅腫，組織脆弱易斷，腸腔內多見串珠樣充氣泡，腸內可見血樣糞便；而n-3組乳鼠出現明顯充血充氣的現象較少，腸內未見明顯的血樣糞便(圖1A)。光學顯微鏡下觀察各組腸組織切片，對照組腸絨毛排列整齊，黏膜下層與固有層連接緊密，未見水腫或充血；NEC組腸絨毛大量脫落缺失，黏膜下層與固有層分離，并大量炎癥細胞浸潤及充血；n-3組腸絨毛完整性尚可，可見黏膜下層與固有層略有水腫，有炎癥細胞浸潤但未見明顯的充血癥狀(圖1B)。經統計提示，n-3組的組織學評分明顯低于NEC組(P<0.05)(圖1C)。另外，腸組織勻漿后取上清進行ELISA檢測也發(fā)現，n-3組炎癥IL-1β及TNF-α的表達水平較NEC組低(P<0.05)(圖2)。

圖1 乳鼠腸組織大體圖 A:對照組腸道光滑，無明顯充血及充氣征；NEC組腸道尤其是回腸部分明顯充血紅腫，腸腔內多見串珠樣充氣泡；n-3處理組腸道充血及充氣程度均較NEC組輕;B:腸組織經HE染色觀察發(fā)現，NEC組腸絨毛脫落缺失，黏膜層嚴重水腫，n-3處理組腸絨毛相對完整，黏膜層水腫不明顯;C:組織學評分提示，n-3組明顯低于NEC組(*表示P<0.05)

圖2 EILSA方法檢測IL-1β及TNF-α炎癥因子表達水平 A:與對照組相比，NEC組的腸組織勻漿上清IL-1β表達水平明顯增高，而n-3處理組的IL-1β表達比NEC組明顯降低；B:與對照組相比，NEC組的腸組織勻漿上清TNF-α表達水平明顯增高，n-3處理組TNF-α表達比NEC組明顯降低(*表示P<0.05)

2.3 n-3多不飽和脂肪酸能上調緊密連接相關蛋白和基因的表達

利用蛋白裂解液提取腸組織蛋白后，我們檢測了各組腸組織中緊密連接相關蛋白的表達水平。結果顯示NEC組的腸組織ZO-1、claudin-4、claudin-7的表達水平較對照組明顯下降，而n-3組則有一定程度的恢復(圖3A-B)。此外，實時熒光定量PCR結果也提示n-3組的ZO-1、claudin-4、claudin-7基因表達水平較NEC組明顯上升(圖3C-E)。

圖3 檢測腸組織緊密連接蛋白表達水平 A:WB結果顯示n-3組ZO-1、claudin-4和claudin-7表達較NEC組明顯上升；B:WB結果灰度值分析；(C-E)實時熒光定量PCR提示n-3處理組ZO-1、claudin-4、claudin-7的mRNA轉錄水平較NEC組明顯上調(*表示P<0.05)

2.4 在炎癥模型的CaCo2細胞中，DHA能提高緊密連接相關蛋白的表達水平和維持細胞緊密連接的穩(wěn)定性

我們在體外模擬炎癥環(huán)境，利用LPS(5 μg/mL)和不同濃度的DHA來處理CaCo2細胞，發(fā)現在LPS誘導下，ZO-1、claudin-4、claudin-7蛋白的表達下調，而DHA可逆轉該趨勢，且呈濃度依賴效應(圖4A)。此外，運用膜蛋白分離提取試劑盒，分別抽提胞膜蛋白及胞漿蛋白進行檢測，結果顯示僅在LPS誘導下ZO-1、claudin-4及claudin-7既分布于細胞膜也分布于細胞漿，并且在胞漿中的含量更高；而當給予DHA處理后，ZO-1、claudin-4和claudin-7細胞膜中的含量則明顯上升(圖4B)。

3 討論

NEC是導致早產兒胃腸道疾病死亡的主要原因。盡管各界醫(yī)療工作者和學術研究者幾十年來對NEC疾病的診治研究付出了巨大的努力， NEC的發(fā)生率及相關的死亡率并沒有大幅降低，并且還隨著超低及極低體重早產兒出生存活率的提高有進一步升高的趨勢[17]。NEC發(fā)病機制目前仍不完全清楚，這也是臨床缺乏有效治療手段的重要原因。臨床研究[18-19]提示，補充長鏈多不飽和脂肪酸可能對體重約1 000～1 500 g或低胎齡≤32周早產兒NEC的發(fā)生有預防作用，但其作用機制仍不明確。本研究通過構建乳鼠NEC模型，發(fā)現補充了富含n-3多不飽和脂肪酸的魚油的乳鼠NEC發(fā)生率及嚴重程度均有所下降，提示n-3多不飽和脂肪酸一定程度上能抑制NEC的發(fā)生發(fā)展。

圖4 CaCo2細胞緊密連接蛋白表達情況 A:WB結果顯示LPS刺激細胞后使ZO-1、claudin-4、claudin-7蛋白表達明顯降低，而同時加入DHA處理后，ZO-1、claudin-4、claudin-7蛋白表達上調，且呈濃度依賴性；B:LPS單獨刺激時ZO-1、claudin-4和claudin-7既分布于胞膜中也分布于胞漿中，而LPS處理后再給予DHA處理，ZO-1、claudin-4和claudin-7胞膜中的含量明顯上升

腸黏膜屏障不僅決定于黏液被，更取決于腸上皮細胞通過細胞連接構成的物理性屏障，緊密連接則是最主要的決定腸上皮通透性的因素[20]。緊密連接由3種類型的緊密連接蛋白構成，包括跨膜蛋白、支架蛋白及調節(jié)蛋白。在跨膜緊密連接蛋白中，四次跨膜蛋白claudin家族是其中最重要的一類，包括claudin 1、claudin 2、claudin3等；ZO家族蛋白屬于支架蛋白，具有多個結構域，可直接與跨膜緊密連接蛋白如claudins及緊密連接相關蛋白家族TAMP如occludin，相互結合；而緊密連接的調節(jié)蛋白目前報道較少[21-22]。有研究表明EPA可通過上調緊密連接蛋白occludin和ZO-1表達水平，維持腸上皮正常通透性[23-24]。在本研究中我們檢測了緊密連接相關蛋白的表達，結果顯示n-3多不飽和脂肪酸可以促進腸組織ZO-1、claudin-4和claudin-7蛋白的表達，進一步提示n-3多不飽和脂肪酸可能是通過維持腸上皮細胞緊密連接起到抑制NEC發(fā)生發(fā)展的作用。

為進一步闡釋n-3多不飽和脂肪酸對緊密連接蛋白的影響，我們采用研究腸道上皮細胞緊密連接的常用細胞系CaCo2細胞建立NEC炎癥模型，驗證n-3多不飽和脂肪酸DHA的作用。通過WB方法檢測發(fā)現LPS刺激細胞后能明顯降低細胞中ZO-1、claudin-4和claudin-7蛋白的表達水平，而DHA能抑制LPS對緊密蛋白表達的降低作用。此外，有研究報道緊密連接蛋白的表達分布改變也會破壞腸道屏障功能，引起腸黏膜通透性增加[25]。本研究采用膜蛋白分離提取試劑盒分別提取細胞膜蛋白與細胞漿蛋白，通過檢測ZO-1、claudin-4和claudin-7的表達分布證實，DHA能促進蛋白從細胞漿向細胞膜更多分布，從而增強LPS誘導下細胞的緊密連接。

綜上所述，我們通過體內外實驗驗證了n-3多不飽和脂肪酸能夠上調緊密連接蛋白表達、改善其分布，以維持腸上皮細胞緊密連接的穩(wěn)定性從而抑制NEC的發(fā)生發(fā)展。本研究揭示了n-3多不飽和脂肪酸在NEC中的作用，提示臨床上具有NEC發(fā)生高風險的早產兒可以考慮通過增加n-3多不飽和脂肪酸的攝入預防NEC的發(fā)生或降低NEC的嚴重程度。