賴彪 王琪 羅剛軍 杜麗娜 王惠聰

摘 ?要：花色苷含量是荔枝果實(shí)呈現(xiàn)鮮紅色的重要次生代謝產(chǎn)物，前人研究結(jié)果表明，LcMYB1通過調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)而影響荔枝果皮中花色苷的積累，其中LcDFR和LcUFGT1是荔枝果皮花色苷生物合成的關(guān)鍵基因，但是LcMYB1如何影響基因的表達(dá)，是否與結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子結(jié)合以及具體結(jié)合區(qū)段目前還不清楚。本研究通過克隆和分析LcDFR和LcUFGT1的啟動(dòng)子區(qū)域并對其進(jìn)行分段處理，利用雙熒光素酶和酵母單雜交實(shí)驗(yàn)，探究LcMYB1與LcDFR和LcUFGT1的啟動(dòng)子的結(jié)合區(qū)域。結(jié)果表明，LcDFR起始密碼子上游1927 bp和LcUFGT1起始密碼子上游1584?bp的啟動(dòng)子上分別有3個(gè)可能的MYB結(jié)合位點(diǎn);雙熒光素酶和酵母單雜交實(shí)驗(yàn)均顯示LcMYB1可以結(jié)合LcDFR基因起始密碼子上游904 bp到1425 bp包含有1個(gè)MYB-CORE元件的區(qū)域，LcMYB1與LcUFGT1基因啟動(dòng)子結(jié)合的區(qū)域是起始密碼到上游610 bp，此區(qū)域包含有2個(gè)MYB-CORE元件。研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了LcMYB1通過與基因LcDFR和LcUFGT1啟動(dòng)子結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用，并縮小了結(jié)合位點(diǎn)的范圍。

關(guān)鍵詞：LcMYB1;花色苷;LcDFR;LcUFGT1;啟動(dòng)子

Abstract： The accumulation of anthocyanins is one of the most important factors in determining the pericarp coloration of litchi. LcDFR （dihydroflavonol 4-reductase） and LcUFGT1 （UDP-glucose： flavonoid 3-O-glucosyltransferase） are two crucial enzymes in the anthocyanin biosynthesis pathway of litchi pericarp， and the activities and gene expressions directly affect litchi fruit coloration. Previous study showed that the expressions of LcDFR and LcUFGT1 were regulated by the LcMYB1 transcription factor. However， how LcMYB1 regulates the expression of the target genes， whether LcMYB1 binds to their promoter， which cis-element in the promoter is the binding site of LcMYB1 remain to be uncovered. In this study， the promoters of LcDFR （1927 bp） and LcUFGT1 （1584 bp） were cloned and analyzed respectively. Six candidate MYB binding sites and some other cis-elements such as light responsive elements and hormone related elements were predicted. The promoters of the two genes were then fragmented and ligated to pGreen-0800-luc plasmid to drive the expression of luciferase （LUC）. Dual luciferase assay indicated that LcMYB1 could activate 904 bp to 1425 bp region of LcDFR promoter and 610 bp upstream of LcUFGT1 gene， which contain 1 and 2 candidate MYB-CORE sites， respectively. The interaction was also confirmed by the yeast one hybrid assay. These results suggested that LcMYB1 regulated the biosynthesis of anthocyanins by directly targeting the promoters of key structural genes and the binding region was narrowed down.

Keywords： LcMYB1; anthocyanins; LcDFR; LcUFGT1; promoter

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）屬于無患子科荔枝屬果樹，是我國南方的特色水果之一，廣受消費(fèi)者喜愛。果實(shí)顏色是果品的重要外觀品質(zhì)指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)，隨著荔枝果實(shí)逐漸成熟，荔枝果皮中葉綠素慢慢褪去，而花色苷不斷合成從而呈現(xiàn)出鮮紅色[1]。花色苷生物合成途徑是類黃酮代謝途徑的一個(gè)分支，參與花色苷生物合成的結(jié)構(gòu)基因包括：查爾酮合成酶（Chalcone synthase， CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（Chalcone isomerase， CHI）、黃烷酮3-羥化酶（Flavanone 3-hydroxylase， F3H）、黃烷酮3′-羥化酶（Flavonoid 3′-hydroxylase， F3′H）、二氫黃酮醇4-還原酶（Dihydroflavonol 4-reductase， DFR）、花青素合成酶（Anthocyanidin synthase， ANS）和類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucose： flavonoid 3-O-glucosyltransferase， UFGT）[2-4]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，荔枝果皮花色苷含量與大部分花色苷生物代謝相關(guān)酶活性正相關(guān)，特別是類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶UFGT[1]。近年來，參與荔枝果皮花色苷生物合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)被克隆，表達(dá)分析結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)基因LcDFR和LcUFGT1的表達(dá)與花色苷含量成顯著正相關(guān)關(guān)系，異源和同源轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)均證實(shí)LcUFGT1在荔枝花色苷生物合成過程中起關(guān)鍵的作用[5-7]。

自20多年前Paz-Ares等從玉米中發(fā)現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子ZmC1基因以來，大量調(diào)控花色苷合成的關(guān)鍵MYB轉(zhuǎn)錄因子從各種草本植物和果實(shí)中得以分離鑒定[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，荔枝花色苷生物合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子LcMYB1的表達(dá)水平與荔枝不同顏色品種果皮、不同組織和不同發(fā)育階段果皮中花色苷含量成正相關(guān)，轉(zhuǎn)LcMYB1煙草的花瓣和葉片中合成大量花色苷，同時(shí)煙草內(nèi)源關(guān)鍵基因NtDFR、NtANS和NtUFGT的表達(dá)也大幅度提高[10]。然而，LcMYB1如何調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的具體結(jié)合區(qū)域尚待研究。

本研究利用基因組信息克隆了荔枝果皮花色苷生物合成的2個(gè)關(guān)鍵基因LcDFR和LcUFGT1的啟動(dòng)子序列，進(jìn)一步通過生物信息學(xué)手段預(yù)測了啟動(dòng)子區(qū)域的MYB結(jié)合位點(diǎn)和其他重要的順式作用元件，并通過啟動(dòng)子5′?端刪減結(jié)合雙熒光素酶和酵母單雜交的方法縮小了LcMYB1激活2個(gè)啟動(dòng)子的范圍，為進(jìn)一步探索LcMYB1結(jié)合啟動(dòng)子的具體順式作用元件奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?植物材料 ?‘妃子笑荔枝采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院教學(xué)實(shí)習(xí)基地，本氏煙草（Nicotiana benthamiana）種植于人工氣候箱（22?℃）。

1.1.2 ?菌株與載體 ?大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司公司;根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101和植物瞬時(shí)表達(dá)載體pEAQ-MYB1由本實(shí)驗(yàn)室保存，pGreen-0800-luc由Roger P. Hellens教授（The New Zealand Institute of Plant and Food Research）饋贈(zèng);植物DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?DNA提取 ?取幼嫩的‘妃子笑葉片為材料，用DNA提取試劑盒提取荔枝葉片基因組DNA，具體方法參見說明書。

1.2.2 ?啟動(dòng)子的克隆及生物信息分析 ?根據(jù)荔枝基因組信息（http：//litchidb.genomics.cn/page/ species/index.jsp），設(shè)計(jì)了特異引物DFRp-F和DFRp-R擴(kuò)增LcDFR啟動(dòng)子，UFGTp-F和UFGTp-R擴(kuò)增LcUFGT1啟動(dòng)子，引物序列見表1。用高保真酶PrimeSTAR? Max DNA Polymerase（Takara）以DNA為模板擴(kuò)增LcDFR和LcUFGT1基因的啟動(dòng)子。擴(kuò)增的DNA片段利用Infusion技術(shù)（Takara）分別與用Nru I和Xho I雙酶切線性化的pGreen-0800-luc連接。測序后，將得到的序列信息在軟件PlantPAN2.0（http：//plantpan2.itps. ncku.edu.tw/）和PlantCARE（http：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）上分析啟動(dòng)子上可能的順式作用元件。

1.2.3 ?不同刪減啟動(dòng)子片段擴(kuò)增及雙熒光素酶載體構(gòu)建 ?為了研究LcMYB1能否與結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子結(jié)合及其具體的結(jié)合區(qū)域，對LcDFR和LcUFGT1啟動(dòng)子進(jìn)行了逐步刪減處理，如圖1所示。利用表1中的引物序列DFRp-F+DFRp-R、DFRp-F2+DFRp-R、DFRp-F3+DFRp-R、DFRp-F4+ DFRp-R分別擴(kuò)增LcDFR基因上游1927、1425、904、433 bp到起始密碼ATG的啟動(dòng)子的序列，得到4個(gè)啟動(dòng)子片段，分別為DFRp、DFRp1、DFRp2、DFRp3。同理，利用UFGTp- F+UFGTp-R、UFGTp-F2+UFGTp-R和UFGTp-F3+ UFGTp-R分別擴(kuò)增了LcUFGT基因上游1580、1093、610 bp到起始密碼的啟動(dòng)子序列，得到了3個(gè)啟動(dòng)子片段UFGTp、UFGTp1、UFGTp2（圖1）。將得到的這些片段利用In-fusion技術(shù)分別于pGreen-0800- luc連接。將經(jīng)測序正確后的載體利用熱激法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101備用。

1.2.4 ?雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) ?轉(zhuǎn)錄因子激活結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的能力通過測定螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase， LUC）檢測，用CaMV：35S驅(qū)動(dòng)的海腎熒光素酶（renilla luciferase， REN）作為對照。用生長4～6周健康的本氏煙草葉片用于瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢火蟲熒光素酶。挑選根癌農(nóng)桿菌在10 mL YEP中培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，用注射緩沖液MAA[10 mmol/L MES（2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid）pH 5.6，10 mmol/L MgCl2，100 mol/L Acetosyringone]懸浮菌液至OD600為1.0左右。用注射器注射含有雙熒光報(bào)告載體和瞬時(shí)表達(dá)載體pEAQ-LcMYB1的根癌農(nóng)桿菌于煙草葉背面，并標(biāo)記好注射范圍，同時(shí)注射含pEAQ-HT的根癌農(nóng)桿菌作為對照，瞬時(shí)表達(dá)和酶活力測定方法參見文獻(xiàn)[11]。

1.2.5 ?酵母單雜交實(shí)驗(yàn) ?酵母單雜交實(shí)驗(yàn)采用Clonteh公司的試劑盒Matchmaker? Gold Yeast One-Hybrid System（Clontech）進(jìn)行。LcDFR基因上游904 bp至1425?bp區(qū)域的序列經(jīng)LcDFRpro-F和LcDFRpro-R擴(kuò)增后，用In-fusion技術(shù)將啟動(dòng)子片段連接到用Kpn I和Xho I酶切線性化的pAbAi載體上。同理，LcUFGT1基因上游610 bp至ATG區(qū)域的序列經(jīng)LcUFGTpro-F和LcUFGTpro-R擴(kuò)增后連接到pAbAi載體上，引物序列見表1。將LcMYB1全長經(jīng)Nde I和BamH I酶切位點(diǎn)連接到pGADT7（AD）載體上。構(gòu)建好的LcMYB1-AD重組質(zhì)粒分別經(jīng)PEG/LiAC介導(dǎo)轉(zhuǎn)入LcDFRpro和LcUFGTpro的酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Leu/AbA平板。30?℃培養(yǎng)3～5 d，觀察酵母生長情況。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ??LcDFR啟動(dòng)子的克隆及順式作用元件分析

基于荔枝基因組信息，利用特異引物經(jīng)過PCR擴(kuò)增測序得到長度為1927 bp 的LcDFR啟動(dòng)子序列信息。將擴(kuò)增測序的啟動(dòng)子序列分別在PlantPAN 2.0和PlantCARE數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索發(fā)現(xiàn)了大量的MYB可能結(jié)合位點(diǎn)。如表2所示，LcDFR啟動(dòng)子上存在3個(gè)MYB-CORE位點(diǎn)（CNGTTR）。此外，還發(fā)現(xiàn)LcDFR基因上游688?bp處有1個(gè)防御與脅迫響應(yīng)元件（TC-rich repeats），在上游463 bp處有1個(gè)溫度響應(yīng)元件（LTR），上游1110 bp處有1個(gè)赤霉素響應(yīng)元件，還有大量的光響應(yīng)元件（表2）。

2.2 ?LcUFGT啟動(dòng)子的克隆及順式作用元件分析

基于荔枝基因組信息，利用特異引物經(jīng)過PCR擴(kuò)增獲得LcUFGT1啟動(dòng)子序列并測序，得到的啟動(dòng)子序列長度為1584?bp。分析發(fā)現(xiàn)LcUFGT1啟動(dòng)子上有3個(gè)MYB-CORE位點(diǎn)。另外還發(fā)現(xiàn)了一些與環(huán)境與激素響應(yīng)元件，比如光響應(yīng)元件（AE-box，ATCT-motif，Box 4，Box I，CATT-motif，G-box，I-box等），溫度響應(yīng)元件（LTR），赤霉素響應(yīng)元件（P-box），茉莉酸響應(yīng)元件（CGTCA-motif），水楊酸響應(yīng)元件（TCA- element）等，具體的位置和序列信息見表3。

2.3 ?LcMYB1結(jié)合LcDFR和LcUFGT1啟動(dòng)子區(qū)域的分析

本研究采用雙熒光報(bào)告基因的檢測方法研究LcMYB1轉(zhuǎn)錄因子和LcDFR與LcUFGT1啟動(dòng)子片段的結(jié)合區(qū)域。如圖1所示，當(dāng)LcDFR啟動(dòng)子從5′?端開始減少到929 bp時(shí)，LcMYB1激活這段啟動(dòng)子的活力下降約70%，說明刪減的這段區(qū)域（上游904?bp至1425?bp）內(nèi)含有LcMYB1結(jié)合的重要順式作用元件。進(jìn)一步分析這段序列內(nèi)的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)該段內(nèi)含有1個(gè)MYB-CORE元件。當(dāng)LcUFGT1啟動(dòng)子刪減到上游610?bp時(shí)，啟動(dòng)子仍然保持著與1584?bp相同的活力。推測在LcUFGT1啟動(dòng)子的最后一段610?bp內(nèi)含有LcMYB1重要順式作用元件，分析發(fā)現(xiàn)該段內(nèi)含有2個(gè)MYB-CORE元件，分別位于上游363?bp和上游85?bp處。

2.4 ?利用酵母單雜交驗(yàn)證LcMYB1結(jié)合LcDFR和LcUFGT1啟動(dòng)子的區(qū)域

將通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的部分啟動(dòng)子序列LcDFR（上游904?bp至1425?bp）和LcUFGT（上游610?bp至ATG）連接到pAbAi質(zhì)粒上得到proLcDER-AbAi和proLcUFGT-AbAi重組質(zhì)粒，將這2個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入Y1H Gold細(xì)胞中在不含有AbA的SD/-Ura上固體培養(yǎng)基上生長正常，說明2個(gè)啟動(dòng)子均已成功轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)胞中。當(dāng)培養(yǎng)基中添加30 mmol/L AbA時(shí)，含有proLcDER- AbAi的酵母不能正常生長;當(dāng)培養(yǎng)基中添加125?mmol/L AbA時(shí)，含有proLcUFGT-AbAi的酵母不能正常生長;說明一定濃度的AbA可以抑制啟動(dòng)子的本底活性。進(jìn)一步將pGADT7-LcMYB1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入含有proLcDER-AbAi和proLcUFGT- AbAi的酵母細(xì)胞后在不含AbA的SD/-Leu培養(yǎng)基上均能正常生長，說明pGADT7-LcMYB1質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入，且在含有AbA的SD/-Leu培養(yǎng)基上也能正常生長，說明LcMYB1編碼的蛋白可以與上述的LcDFR和LcUFGT1啟動(dòng)子片段結(jié)合（圖2）。

3 ?討論

在植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中，啟動(dòng)子上的順式作用元件起著非常重要作用，反式作用因子通過與順式作用元件結(jié)合調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響特定的基因的時(shí)空表達(dá)特性及響應(yīng)外界信號。植物花色苷生物合成是次生代謝途徑中研究最為深入的途徑之一，轉(zhuǎn)錄因子MYB-bHLH-WD40蛋白復(fù)合體通過與花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)控其轉(zhuǎn)錄[12-14]。在煙草中，NtAn2（R2R3- MYB）能與bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合體調(diào)控花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因NtCHS和NtDFR的啟動(dòng)子，從而調(diào)控花色苷的積累[15-16]。矮牽牛中，PhJAF13（bHLH轉(zhuǎn)錄因子）和PhAN2（MYB轉(zhuǎn)錄因子）互作可以結(jié)合到PhDFR基因的啟動(dòng)子上[17]。在亞洲百合中，LhMYB12和LhMYB6能分別與LhbHLH2相互作用激活結(jié)構(gòu)基因LhDFR，LhCHSa和LhCHSb的表達(dá)[18]。MdMYB1是光調(diào)控蘋果果皮花色苷積累的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其可以激活花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因MdDFR和MdUFGT的表達(dá)，楊梅的MrMYB1和AtbHLH共同表達(dá)時(shí)可以促進(jìn)擬南芥AtDFR的啟動(dòng)子活性增加，MrMYB1與MrbHLH1相互作用可以調(diào)控楊梅果實(shí)中花色苷生物合成途徑中的大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因[19-21]。上述的研究結(jié)果說明，MYB轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合到結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子并激活其轉(zhuǎn)錄，決定花色苷是否積累和積累多少。在荔枝中，LcMYB1的表達(dá)水平與不同組織、不同荔枝品種果皮、同一品種不同發(fā)育階段果皮中花色苷含量正相關(guān)，同時(shí)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因LcDFR和LcUFGT的表達(dá)模式與LcMYB1一致，這說明LcDFR和LcUFGT可能是LcMYB1的下游靶基因[5， 7， 10]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子一般結(jié)合在啟動(dòng)子的兩類順式作用元件MYB-CORE elements （CNGTTR，也稱MBS）和AC-rich elements（[A/C]CC[A/T]A [A/C]）[9]。LcDFR和LcUFGT1是荔枝花色苷生物合成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因[5， 7]。它們的啟動(dòng)子序列包括有大量的順式作用元件，其中LcDFR和LcUFGT1啟動(dòng)子上分別含有1和3個(gè)MYB-CORE元件。本研究通過啟動(dòng)子5′?端刪減的方法，確定了LcMYB1激活LcDFR基因起始密碼上游929 bp到1449?bp的啟動(dòng)子區(qū)域，該區(qū)段僅包含1個(gè)MYB- CORE，LcUFGT1基因起始密碼到上游617?bp的區(qū)域，該區(qū)段包含2個(gè)MYB-CORE。進(jìn)一步利用酵母單雜交實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了LcMYB1可以結(jié)合到LcDFR和LcUFGT1啟動(dòng)子的這部分片段上。在葡萄中，通過酵母單雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VvMYBA1也可以結(jié)合到VvDFR和VvUFGT啟動(dòng)子上，但是具體的區(qū)段并沒有進(jìn)一步分析[22]。本論文利用雙熒光素酶和酵母單雜實(shí)驗(yàn)證明了LcMYB1通過結(jié)合到LcDFR和LcUFGT1的啟動(dòng)子激活基因表達(dá)，從而發(fā)揮調(diào)控花色苷生物合成的作用，并且利用截短啟動(dòng)子序列的手段縮小了LcMYB1結(jié)合到啟動(dòng)子上的區(qū)域范圍，為進(jìn)一步的精確定位LcMYB1結(jié)合的順式作用元件奠定良好的基礎(chǔ)。

分析還發(fā)現(xiàn)在LcDFR和LcUFGT啟動(dòng)子上還發(fā)現(xiàn)了大量的光響應(yīng)元件，前期研究發(fā)現(xiàn)套袋遮光抑制荔枝果皮花色苷積累，同時(shí)LcDFR和LcUFGT的轉(zhuǎn)錄也顯著受抑制，這有可能和它們啟動(dòng)子上的光響應(yīng)元件有一定的關(guān)系[5， 23]。此外，在LcDFR和LcUFGT啟動(dòng)子上還發(fā)現(xiàn)了一些脅迫響應(yīng)和激素響應(yīng)元件，是否這些元件也參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄還需要進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：崔麗虹