蔡國(guó)倩 寧書菊 葉齊 胡永樂 馬小毛 魏道智

摘 ?要：吲哚-3-甘油磷酸合酶（indole-3-glycerol phosphate synthase，IGPS）是廣泛參與生物體內(nèi)色氨酸、生長(zhǎng)素等吲哚化合物合成途徑中重要的關(guān)鍵酶之一。為了研究BcIGPS在馬藍(lán)吲哚類生物堿合成中的作用，基于馬藍(lán)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過RT-PCR技術(shù)從馬藍(lán)中克隆得到IGPS基因序列，命名為BcIGPS;利用生物信息學(xué)分析BcIGPS序列特性;運(yùn)用qPCR分析BcIGPS在馬藍(lán)不同器官及外源誘導(dǎo)處理下的時(shí)空表達(dá)情況;構(gòu)建pET-32a-BcIGPS原核表達(dá)載體，并優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件。結(jié)果表明：BcIGPS（GenBank登錄號(hào)：MT210517）全長(zhǎng)為1176 bp，包含1個(gè)開放閱讀框（ORF），編碼392個(gè)氨基酸，具絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)31個(gè)，無跨膜結(jié)構(gòu)，無信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位于葉綠體中。BcIGPS含有product（indole）活性結(jié)構(gòu)域和IGPS、TrpC特異性位點(diǎn)。qPCR分析結(jié)果顯示，BcIGPS基因在不同器官的相對(duì)表達(dá)豐度依次為：葉>莖>花>根;其響應(yīng)茉莉酸甲酯（MeJA）、脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）、乙烯利（ETH）外源誘導(dǎo)信號(hào)的誘導(dǎo)，經(jīng)MeJA和ETH處理后，分別在24 h和36 h最高，為初始水平的5.53、6.87倍;在SA處理下，BcIGPS表達(dá)響應(yīng)最為強(qiáng)烈，呈先驟升后驟降的變化趨勢(shì)，在12 h最高達(dá)初始水平的33.13倍;ABA處理后，其表達(dá)量變化不顯著。所構(gòu)建的pET-32a-BcIGPS原核表達(dá)載體在大腸桿菌BL21中表達(dá)，其最適條件為37?℃、0.4 mmol/L IPTG培養(yǎng)3 h，BcIGPS重組蛋白主要以包涵體形式存在，且蛋白分子量與預(yù)測(cè)相符。

關(guān)鍵詞：馬藍(lán);BcIGPS;基因克隆;表達(dá)分析;原核表達(dá)

Abstract： Indole-3-glycerol phosphate synthase （IGPS） is one of the most key enzymes involved in the synthesis of indole compounds such as tryptophine and auxin in organisms. In order to study the function of BcIGPS in the synthesis of the indole alkaloids from Baphicacanthus cusia， based on the transcriptome data of B. cusia， the gene sequence of IGPS was obtained by RT-PCR， the BcIGPS sequence characteristics was analyzed by bioinformatics. qPCR analysis was used to analyze the spatiotemporal expression of B. cusia in different organs and exogenous induction. The prokaryotic expression vector of pET-32a-BcIGPS was constructed and the conditions were optimized for inducing expression. Results showed that BcIGPS （GenBank login number： MT210517） contained an open reading frame （ORF） of 1176 bp， encoded 392 amino acids without transmembrane structure and signal peptide. There were 31 phosphorylation sites for Ser， Thr and Tyr. Subcellular localization prediction showed that BcIGPS was located on the chloroplasts. And BcIGPS contained product （indole） active structure domain and specific sites of IGPS and TrpC. The results of qPCR showed that the relative expression abundance of BcIGPS in different organs was leaf>stem>flower>root. It responsed to the induction of exogenous MeJA， SA， ETH. After the treatment of MeJA and ETH， the maximum value was up to 5.53， 6.87 times at 24 h and 36 h respectively. BcIGPS showed the strongest response to SA treatment， the expression level increased quickly and then decreased sharply， more 33.13 times than the initial level at 12 h. After ABA treatment， there was no significant change in the expression level. The prokaryote expression of pET-32a-BcIGPS was constructed successfully and the optimal conditions for expression in E. coli BL21 was 37 ℃， 0.4 mmol/L IPTG and cultured for 3 h. The recombinant BcIGPS protein mainly existed in the form of inclusion body， and the molecular weight of BcIGPS was consistent with the prediction.

Keywords： Baphicacanthus cusia; BcIGPS; gene cloning; expression analysis; prokaryotic expression

馬藍(lán)（Baphicacanthus cusia）屬爵床科板藍(lán)屬多年生草本植物，主要分布在我國(guó)亞熱帶及熱帶等地區(qū)，是重要傳統(tǒng)中藥材青黛的原植物和染料資源[1]。馬藍(lán)全草具藥用價(jià)值，其根及根莖為南板藍(lán)根[2];由莖葉泡制加工成青黛，具有治療口瘡、喉痹、傳染性皮膚病等功效[3]。研究表明，中藥青黛的主要藥效成分為吲哚類生物堿的靛玉紅和靛藍(lán)，靛玉紅具有抑制惡性腫瘤等作用，在臨床用于治療慢性粒細(xì)胞性白血病;靛藍(lán)是一種天然的抗菌植物色素，普遍應(yīng)用于食品、印染、化妝品等行業(yè)[4-5];因此，靛玉紅、靛藍(lán)的合成途徑受到諸多領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。

馬藍(lán)吲哚類生物堿代謝通常有莽草酸途徑（shikimate pathway）[6]和色氨酸途徑[7]。在莽草酸代謝途徑中，以磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤蘚糖-4-磷酸（E4P）為底物，經(jīng)5-烯醇式莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）[8]合成5-烯醇式莽草酸-3-磷酸，由分支酸合成酶（CS）[9]催化轉(zhuǎn)變成分支酸，經(jīng)鄰氨基苯甲酸合成酶（ASA/ASB）[10]生成鄰氨基苯甲酸，由吲哚-3-甘油磷酸合酶（IGPS）催化生成吲哚-3-甘油酸后，經(jīng)色氨酸合成酶（TSA）[11]作用下形成吲哚。而在色氨酸代謝途徑中，色氨酸直接由色氨酸酶催化為吲哚。由細(xì)胞色素P450（CYP450）氧化酶將吲哚氧化為2-羥基吲哚和3-羥基吲哚，再氧化為吲哚酚，吲哚酚進(jìn)一步加氧、聚合成靛藍(lán)、靛玉紅及其他吲哚類物質(zhì)。因此，研究其代謝途徑中的關(guān)鍵基因?qū)τ隈R藍(lán)藥效成分積累機(jī)制的研究具有重要意義。

吲哚-3-甘油磷酸合酶（IGPS， EC：4.1.1.48）是合成生物體內(nèi)必需氨基酸色氨酸和植物內(nèi)源激素吲哚-3-乙酸（IAA）2條途徑分支點(diǎn)的重要酶，且可催化生物堿、植物抗毒素和硫代葡萄糖苷等吲哚環(huán)狀化合物的合成[12]。在菘藍(lán)和微生物工程的靛藍(lán)代謝途徑中，IGPS也被認(rèn)為是調(diào)控吲哚類生物堿（靛藍(lán)）合成中的關(guān)鍵酶之一。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)IGPS作為馬藍(lán)關(guān)鍵藥效物質(zhì)合成途徑中限速酶的研究報(bào)道。因此，本研究擬利用馬藍(lán)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆得到BcIGPS基因序列，對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并分析BcIGPS在馬藍(lán)不同組織器官的表達(dá)模式及其在不同外源誘導(dǎo)處理下的表達(dá)特異性，構(gòu)建pET-32a-BcIGPS原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)BcIGPS的重組蛋白，以期為后續(xù)該基因研究及分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

馬藍(lán)取自福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥用植物園，在馬藍(lán)旺盛生長(zhǎng)期分別取根、莖、葉、當(dāng)天開放的花，經(jīng)無菌水洗凈后液氮冷凍，于–80?℃冰箱保存待用。

1.2 ?方法

1.2.1 ?激素處理 ?配置濃度為100??mol/L的茉莉酸甲酯（MeJA）、脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）、乙烯利（ETH）溶液處理，每種處理3個(gè)重復(fù)。在處理0、1、2、4、6、8、12、18、24、36、48、72?h后取材，置液氮速凍后，于–80?℃冰箱保存待用。

1.2.2 ?RNA提取及cDNA合成 ?根據(jù)RNA提取試劑盒說明書，分別提取不同器官及外源誘導(dǎo)處理后馬藍(lán)的總RNA，通過分別檢測(cè)RNA質(zhì)量，將質(zhì)量高的總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于–20?℃保存待用。

1.2.3 ?BcIGPS基因的克隆 ?通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)BcIGPS基因的引物并分別添加XbaⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的保護(hù)堿基，BcIGPS的正向引物序列為：5-CTAGTCTAGATCCAT CCTCCATCACTCTG-3和BcIGPS的反向引物序列為：5-ACGCGTCGACAGGAGTATCCAAGTT GTGCTG-3。以馬藍(lán)cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：2×Taq PCR Master Mix 10?μL，上下游引物各1?μL，cDNA模板1?μL，ddH2O 7?μL。擴(kuò)增程序：94?℃預(yù)變性5?min;94?℃ 30?s，58?℃ 30?s，72?℃ 90?s，30個(gè)循環(huán);72?℃延伸10?min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將目的條帶回收，連接至Blunt Simple T載體上，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α中，涂板，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，并將陽性菌液送福州鉑尚生物有限公司測(cè)序。

1.2.4 ?BcIGPS基因的生物信息分析 ?利用ORF finder軟件查找開放閱讀框，采用在線分析軟件ExPASy-ProtParam tool分析氨基酸理化性質(zhì)。利用DNAMAN 8.0軟件和NCBI在線Blastp進(jìn)行同源蛋白序列及進(jìn)化發(fā)育樹分析和構(gòu)建。利用ExPASy-ProtScale、NetNGlyc 3.0 Server軟件預(yù)測(cè)親/疏水性和磷酸化位點(diǎn)，利用SOPMA、SWISS- MODEL軟件分別預(yù)測(cè)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用Blast與SMART在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域，利用SignalIP4.1Server軟件預(yù)測(cè)信號(hào)肽，利用TMHMM軟件分析跨膜結(jié)構(gòu)域，利用ProtCompv. 9.0軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。

1.2.5 ?qPCR分析 ?設(shè)計(jì)BcIGPS基因的特異引物，正向序列：F-5-ACTTGTTGAGGTACATGAT GAGAC-3;反向序列：R-5-GCAATATCGGCA GGAGTGAA-3。選擇β-actin為內(nèi)參基因，其引物正向序列：F-5-GAGGGCCAAAACAAACTT GA-3;反向序列：R-5-CCCTTATGTGCCTTTGC CTA-3。使用Light Cycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，根據(jù)2-△△CT公式處理數(shù)據(jù)。

1.2.6 ?pET-32a-BcIGPS原核表達(dá)載體的構(gòu)建 ?將測(cè)序正確的T-BcIGPS重組質(zhì)粒和pET-32a載體質(zhì)粒分別用限制內(nèi)切酶XbaⅠ、SalⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)電泳檢測(cè)后，回收酶切目的片段，連接目的基因片段和載體片段，16?℃金屬浴中連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后，涂在含氨芐抗性的LB板進(jìn)行初步篩選，挑單菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切和菌液PCR鑒定為陽性菌液，送福州鉑尚生物有限公司測(cè)序。

1.2.7 ?BcIGPS重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) ?將驗(yàn)證正確的陽性菌（pET-32a-BcIGPS）進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，按1：100比例將菌液轉(zhuǎn)入含50?ng/μL氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8;加入濃度分別為0.3、0.4、0.5?mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)條件為37?℃，200?r/min搖床，振蕩培養(yǎng)2、3、4、5、6?h;誘導(dǎo)完成后，在4?℃，12 000?r/min下離心10?min，倒培養(yǎng)液留菌體，加1 mL磷酸緩沖鹽溶液（1×PBS）懸浮菌體，進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎，設(shè)置破碎時(shí)工作5 s，間歇10 s，循環(huán)30次，破碎后的溶液為總蛋白，經(jīng)4?℃，12?000?r/min離心15?min后，總蛋白即分為上清蛋白和沉淀蛋白。將需上樣的蛋白經(jīng)過預(yù)處理后，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?BcIGPS基因克隆及序列比對(duì)

根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取馬藍(lán)總RNA，通過凝膠電泳檢測(cè)顯示18S、28S兩條帶。以馬藍(lán)cDNA為模板克隆得到BcIGPS基因，測(cè)序結(jié)果顯示，該基因包含一個(gè)全長(zhǎng)為1176?bp的開放閱讀框（ORF）（圖1）。通過NCBI在線Blastp對(duì)BcIGPS蛋白進(jìn)行同原序列搜索，選取10種不同物種的IGPS氨基酸序列（圖2），結(jié)果表明，BcIGPS基因編碼的氨基酸序列與蓖麻（Ricinus communis， XP_002532209.1）、毛白楊（Populus tomentosa， AXY97877.1）、南瓜（Cucurbita moschata， XP_022952396.1）、山黃麻（Parasponia andersonii， PON44253.1）、筍瓜（Cucurbita maxima， XP_022969112.1）、甜椒（Capsicum annuum， XP_016563733.1）、夏威夷棉（Gossypium tomentosum， TYH63509.1）、煙草（Nicotiana tabacum， NP_001312356.1）、野生大豆（Glycine soja， KHN38572.1）相似性分別為79.60%、78.98%、83.54%、79.37%、82.42%、81.27%、80.35%、81.74%、81.48%，BcIGPS蛋白與南瓜的IGPS氨基酸序列有著較高的相似性。利用DNAMAN 8.0軟件對(duì)不同物種的IGPS氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果表明，馬藍(lán)的IGPS獨(dú)自聚成一支，甜椒和煙草聚成一支，其他7種物種聚成一支（圖3）。

2.2 ?BcIGPS理化性質(zhì)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

采用在線分析軟件ExPASy-ProtParam tool預(yù)測(cè)BcIGPS蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，BcIGPS蛋白分子式為C1932H3126N540O565S14，分子量約為43.41?kDa，等電點(diǎn)（pI）為8.42，其中Leu（L）和Ala（A）比例較高分別為10.2%、8.9%。應(yīng)用軟件ExPASy-ProtScale預(yù)測(cè)分析，正值為疏水值，反之負(fù)值為親水值。在–1.00以下的親水峰有27處，+1.00以上的疏水峰有19處，表明BcIGPS蛋白是一個(gè)親水性蛋白（圖4）。采用NetNGlyc 3.0 Server在線軟件對(duì)BcIGPS蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，分值在0.5以上的磷酸化位點(diǎn)有31個(gè)，其中絲氨酸（Ser）20個(gè)，蘇氨酸（Thr）10個(gè)，酪氨酸（Tyr）1個(gè)（圖5）。

2.3 ?BcIGPS蛋白的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位

通過SignalIP 4.1軟件預(yù)測(cè)信號(hào)肽，發(fā)現(xiàn)BcIGPS蛋白的1～45個(gè)氨基酸的平均切割點(diǎn)為0.450，預(yù)測(cè)分析BcIGPS蛋白的N端不具有信號(hào)肽。運(yùn)用TMHMM 2.0軟件預(yù)測(cè)馬藍(lán)IGPS蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)域的可能性很小，表明BcIGPS基因編碼的產(chǎn)物不屬于跨膜蛋白。采用ProtCompv 9.0在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)蛋白質(zhì)做整體定位評(píng)分，葉綠體（7.98）遠(yuǎn)高于線粒體（0.81）、液泡（0.7）、高爾基（0.51）亞細(xì)胞器。表明BcIGPS蛋白亞細(xì)胞定位于葉綠體與馬藍(lán)的光合作用有關(guān)。

2.4 ?BcIGPS蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域

采用在線軟件SOPMA對(duì)BcIGPS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，BcIGPS蛋白的主要元件由45.15%的α-螺旋、33.93%的無規(guī)則卷曲、14.03%的β-折疊、6.89%的β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖6）。運(yùn)用在線工具SWISS-MODEL模擬出BcIGPS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)（管狀和球棒）模型（圖7）。通過Blast與SMART數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)，BcIGPS蛋白含有關(guān)鍵活性結(jié)構(gòu)域phosphate、ribulose/triose、substrate（anthranilate）、product（indole），特異性位點(diǎn)有PLN02460、IGPS、TrpC，并且屬于DRE-TIM-me tallolyase和TIM-phosphate-binding超家族（圖8）。

2.5 ?BcIGPS在不同器官的特異性表達(dá)及在不同外源誘導(dǎo)子下的響應(yīng)情況

通過qPCR檢測(cè)BcIGPS基因在馬藍(lán)不同器官中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，葉中最高，其次是莖和花，且分別為根的34.78、20.58和10.41倍，根中最低（圖9）。表明BcIGPS基因在馬藍(lán)葉、莖及花的生長(zhǎng)發(fā)育中表達(dá)較活躍，這與該基因的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

經(jīng)不同外源誘導(dǎo)子處理后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ABA誘導(dǎo)下，BcIGPS基因表達(dá)變化不顯著;經(jīng)MeJA處理后，BcIGPS表達(dá)量的整體變化呈先降后升再降的趨勢(shì)，且在24?h達(dá)到最高，是對(duì)照組的5.53倍;經(jīng)ETH誘導(dǎo)36?h后，BcIGPS表達(dá)量達(dá)到最高，是對(duì)照組的6.87倍。SA處理1?h后，BcIGPS表達(dá)量快速且持續(xù)上升表達(dá)，在12?h達(dá)到最高，是初始水平的33.13倍（圖10）。表明SA、MeJA及ETH可有效調(diào)控BcIGPS基因的表達(dá)，相比其他誘導(dǎo)子，BcIGPS基因?qū)A的應(yīng)答快速且表達(dá)顯著增強(qiáng)。

2.6 ?pET-32a-BcIGPS原核表達(dá)載體的構(gòu)建

原核表達(dá)載體pET-32a和T-BcIGPS的質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶XbaⅠ和SalⅠ分別進(jìn)行雙酶切，通過T4 DNA連接酶，原核表達(dá)載體pET-32a-BcIGPS經(jīng)初步構(gòu)建后，轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3），挑單菌落經(jīng)培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和菌液PCR（圖11）。電泳結(jié)果顯示，pET-32a-BcIGPS原核表達(dá)載體經(jīng)雙酶切后，有2條帶分別為5200?bp左右的pET-32a和1200?bp左右的BcIGPS。將酶切鑒定的陽性菌液送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示完全一致，說明原核表達(dá)載體pET-32a-BcIGPS構(gòu)建成功。

2.7 ?BcIGPS重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的pET-32a-BcIGPS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3），然后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，其條件為：分別加入為0.3～0.5?mmol/L濃度的IPTG，在37?℃、200?r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)2～6 h;提取BcIGPS重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖12）。由圖12可知，在0.4?mmol/L IPTG，經(jīng)3?h誘導(dǎo)后，含pET-32a-BcIGPS質(zhì)粒的表達(dá)菌株顯示目的蛋白條帶在約45?kDa處。重組蛋白是由43.41?kDa的BcIGPS和一個(gè)分子量約為0.84?kDa的His標(biāo)簽蛋白組成，符合預(yù)期BcIGPS蛋白的分子量大小。BcIGPS重組蛋白在沉淀的條帶明顯亮于上清的條帶，表明重組蛋白主要以包涵體的形式存在。

3 ?討論

吲哚類生物堿作為一類重要的生物活性成分，其合成途徑一直是分子生藥學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。林文津[13]、黃玉香[14]參考KEGG代謝途徑及菘藍(lán)、長(zhǎng)春花、蓼藍(lán)等的吲哚生物堿合成途徑，測(cè)序并解析了馬藍(lán)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGPS基因表達(dá)處于上調(diào)，并推測(cè)其參與調(diào)控馬藍(lán)藥效物質(zhì)青黛的合成。已有研究結(jié)果表明，IGPS基因主要有2個(gè)功能：一是參與合成植保素途徑及植物防御反應(yīng)，在環(huán)境脅迫因子的作用下，IGPS基因蛋白水平表達(dá)增加[15];二是調(diào)控色氨酸代謝途徑，有研究通過產(chǎn)生IGPS缺陷型轉(zhuǎn)基因植物，表現(xiàn)出一些類似生長(zhǎng)素缺陷的表型（小蓮座和低生育力），同時(shí)色氨酸含量顯著下降[16]。因此，BcIGPS基因和植物的防御性代謝有密切關(guān)系，研究BcIGPS基因不僅對(duì)于了解馬藍(lán)生長(zhǎng)發(fā)育過程中的防御機(jī)制具有重要作用，而且對(duì)馬藍(lán)藥效成分的合成途徑研究具有一定的意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BcIGPS蛋白存在保守結(jié)構(gòu)域，蛋白中含有product（indole）關(guān)鍵活性結(jié)構(gòu)域、TrpC和IGPS特異性結(jié)合位點(diǎn)，符合該基因參與合成吲哚環(huán)狀物質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)特點(diǎn);此外，有研究發(fā)現(xiàn)一些真菌和細(xì)菌的L-色氨酸合成途徑由7個(gè)色氨酸基因編碼的5個(gè)關(guān)鍵酶完成，其中吲哚-3-甘油磷酸合酶由TrpC基因編碼[17-18];經(jīng)序列分析結(jié)果表明，馬藍(lán)與蓖麻、南瓜、山黃麻、筍瓜、甜椒、夏威夷棉、煙草、野生大豆等其他雙子葉植物的IGPS基因相似度達(dá)79%～ 83%，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均驗(yàn)證了馬藍(lán)IGPS基因的成功克隆。

通過qPCR對(duì)馬藍(lán)進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析，BcIGPS在馬藍(lán)的根、莖、葉及花的表達(dá)量有明顯差異，葉、莖中BcIGPS蛋白的相對(duì)表達(dá)量比根分別高達(dá)34.78、20.58倍，青黛實(shí)際生產(chǎn)也是以葉、莖為加工原料器官，說明BcIGPS的存在與馬藍(lán)藥效物質(zhì)形成部位的一致。此外，葉和莖也是葉綠體主要分布的器官，這與BcIGPS蛋白定位于葉綠體的預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

外源誘導(dǎo)子與植物的次生代謝關(guān)系密切，常用來調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物的合成[19]，如白及的苯丙烷[20]、藏紅花的藏紅花素[21]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)馬藍(lán)BcIGPS基因均響應(yīng)MeJA、ETH及SA誘導(dǎo)表達(dá)且上調(diào)，尤其經(jīng)SA處理后，BcIGPS基因快速響應(yīng)且強(qiáng)度是MeJA和ETH誘導(dǎo)反應(yīng)的5～6倍。SA作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，不僅參與植物生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)光周期、調(diào)控乙烯合成等重要的代謝過程[22]，而且可激活雙子葉植物的抗旱、抗鹽的防御反應(yīng)，起到信號(hào)分子的作用[23-24]。因此，這也表明靛藍(lán)、靛玉紅的合成代謝包括在馬藍(lán)的次生代謝途徑中，其合成與馬藍(lán)的防御代謝有關(guān)。

4 ?結(jié)論

本研究克隆獲得的BcIGPS（GenBank登錄號(hào)：MT210517）包含一個(gè)全長(zhǎng)為1176 bp的ORF，編碼392個(gè)氨基酸，定位于葉綠體中，成功構(gòu)建pET-32a-BcIGPS原核表達(dá)載體并實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。BcIGPS基因可強(qiáng)烈響應(yīng)外源誘導(dǎo)子SA的誘導(dǎo)，該基因在馬藍(lán)生長(zhǎng)發(fā)育中起到增強(qiáng)相關(guān)抗脅迫代謝的能力。該研究結(jié)果為進(jìn)一步對(duì)馬藍(lán)吲哚類生物堿代謝調(diào)控研究提供科學(xué)依據(jù)。

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