王 歡，劉明珠，蘆永昌*

(1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海 西寧 810007；2.青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007；3.青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007；4.青海省現(xiàn)代藏藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，青海 西寧 810007)

野決明學(xué)名披針葉黃華(Thermopsislanceolata)是我國西部地區(qū)早春的重要野生蜜源植物，也是一種重要的固沙植物[1-3]。披針葉黃華屬豆科野決明屬，主要分布在中國西北地區(qū)，20世紀(jì)60年代前蘇聯(lián)人對(duì)其生物堿研究較多，金雀花堿類是指分子內(nèi)具有α-吡啶酮環(huán)的三環(huán)或四環(huán)結(jié)構(gòu)的喹諾里西啶類生物堿化合物，野生植物披針葉黃華的種子及全草中含有大量此類生物堿，其極強(qiáng)的生物活性從上世紀(jì)70年代起就引起了人們關(guān)注[4-7]。臨床用金雀花堿0.15%水溶液供肌肉或靜脈注射，搶救因手術(shù)和各種創(chuàng)傷引起的反射性呼吸暫停、休克和新生兒窒息等。近期研究表明該類生物堿還具有抗心率失常、抗微生物感染、抗?jié)?、升高白?xì)胞等多方面的藥理作用，特別是該類化合物較強(qiáng)的抗癌活性[8]。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑、藥材

HX501T電子天平(浙江省慈溪市天東衡器廠)；RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水多用真空泵(上海予英儀器有限公司)；TU-1800紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。

金雀花堿對(duì)照品(上海原葉生物有限責(zé)任公司)；乙醇為分析純；水為超純水。

2020年7月，野決明采于青海省互助北山，經(jīng)青海民族大學(xué)蘆永昌教授鑒定為披針葉黃華(Thermopsislanceolata)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取金雀花堿對(duì)照品，以氯仿溶解，配制成含金雀花堿0.2mg/ml的對(duì)照品溶液，分別取0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml的對(duì)照品溶液于25ml量瓶中，用氯仿定容，在最大吸收波長315nm處測(cè)定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，金雀花堿濃度(μg·ml-1)為橫坐標(biāo)，得到一條通過原點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：Y=0.0359X+0.1063(r=0.9998)。金雀花堿在2.4-20μg·ml-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure.1 Standard curve

1.2.2 溶液的制備

精密稱取金雀花堿對(duì)照品，以氯仿溶解，配制成含金雀花堿0.2mg·ml-1的對(duì)照品溶液。將野決明全草曬干，粉碎，過40目篩后，精密稱取10g，加85%乙醇熱回流提取，得到的濾液減壓濃縮，加2mol·ml-1HCl調(diào)pH=3，用等量氯仿連續(xù)萃取4次，去除色素和脂溶性雜質(zhì)，得到的酸水層以10%NaOH調(diào)pH=10～11，用等量氯仿連續(xù)萃取6次，合并氯仿層，濃縮定容至50ml量瓶中，吸取0.1ml此溶液再用氯仿定容至25ml，作為供試品溶液。

1.2.3 含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取10g披針葉黃華全草，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制得到不同樣品溶液。在315nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到野決明中總生物堿的含量。

1.3 單因素試驗(yàn)

野決明風(fēng)干至恒重，粉碎，過40篩，精確稱取10g干粉，按不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行加熱回流提取，過濾，定容，得樣品溶液，按照“1.2.3”項(xiàng)下測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算野決明中總生物堿含量，分別確定最適乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)[9]。

1.4 正交試驗(yàn)及優(yōu)選

在野決明總生物堿提取單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)影響總生物堿提取的主要因素(乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù))進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，確定野決明總生物堿提取最佳條件，野決明經(jīng)粉碎后按比例稱取9份，每份10g，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，加熱回流提取，過濾，定容，即得1～9號(hào)樣品溶液，測(cè)定金雀花堿含量[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度數(shù)對(duì)總生物堿提取率的影響

在其他條件相同的情況下，分別在315nm處測(cè)定溫度為60℃、65℃、70℃、75℃、80℃時(shí)的吸光度值，測(cè)定結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線所得總生物堿含量如圖2所示。由試驗(yàn)結(jié)果可知，提取溫度為70℃時(shí)，野決明中總生物堿的提取率最大達(dá)到12.32mg/g，當(dāng)溫度高于或者低于70℃時(shí)，提取率都不理想。因此，以下實(shí)驗(yàn)中所采用的提取溫度為70℃。

圖2 提取溫度對(duì)總生物堿提取率的影響Figure.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield of total alkaloids

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)金雀花堿提取的影響

在其他條件相同的情況下，分別在315nm處測(cè)定乙醇：水體積比分別為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)的吸光度值，測(cè)定結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線所得總生物堿含量如圖3所示。由圖3研究結(jié)果可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，野決明中總生物堿的提取率最大為12.33mg/g，當(dāng)乙醇體積繼續(xù)增大時(shí)，提取率稍微有所下降，可能是總生物堿的在乙醇中的溶解度達(dá)到上限。因此，以下實(shí)驗(yàn)中所使用的乙醇體積為60%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總生物堿提取率的影響Figure.3 Effect of ethanol volume fraction on the extraction yield of total alkaloids

2.1.3 料液比對(duì)金雀花堿提取的影響

在其他條件相同的情況下，分別在315nm處測(cè)定不同料液比1g∶5ml、1g∶10ml、1g∶15ml、1g∶20ml、1g∶25ml的吸光度值，測(cè)定結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線所得總生物堿含量如圖4所示。研究結(jié)果表明，當(dāng)料液比為1g∶10ml時(shí)，野決明中總生物堿的提取率最高，為12.41mg/g，說明一定量的溶劑可將有效成分完全溶出，再增加乙醇量，提取效果變化不明顯。因此，為節(jié)省原料，以下試驗(yàn)料液比均采用1g∶10ml。

圖4 料液比對(duì)總生物堿提取率的影響Figure.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of total alkaloids

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)金雀花堿提取的影響

在以上最優(yōu)試驗(yàn)條件下，分別在315nm處測(cè)定處測(cè)定回流0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h的吸光度值，測(cè)定結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線所得總生物堿含量如圖5所示。研究結(jié)果表明，隨著回流時(shí)間的延長總生物堿的提取率也在提高，當(dāng)提取時(shí)間超過1.5h(12.52mg/g)后，總生物堿的提取量增加緩慢，為實(shí)現(xiàn)高效提取，最佳的提取時(shí)間選擇1.5h。

圖5 提取時(shí)間對(duì)總生物堿提取率的影響Figure.5 Influence of extraction times on the extraction yield of total alkaloids

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比(A)、溫度(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)和提取時(shí)間(D)為指標(biāo)，進(jìn)一步研究各因素對(duì)野決明中總生物堿提取的影響，采用L9(34)4因素3水平正交試驗(yàn)，確定總生物堿提取的最佳工藝，各因素水平見表1，由極差分析(表2)可知，各因素作用主次分別為D>A>C>B，說明提取試驗(yàn)的料液比是影響野決明中總生物堿提取的最重要變異因素，最佳提取工藝為A3B2C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1g∶15ml、提取時(shí)間1.5h、提取溫度為70℃。各因素方差分析(表3、表4)。

表1 乙醇提取工藝正交試驗(yàn)因素水平Table.1 Orthogonal experimental factors of ethanol extraction process

表2 乙醇提取野決明中中金雀花堿正交試驗(yàn)結(jié)果Table.2 Orthogonal test results of cytisine type alkaloids in ethanol extraction from Thermopsis lanceolate

表3 金雀花堿方差分析表Table.3 Analysis of variance of cytisine type alkaloids

2.3 精密度試驗(yàn)

取“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1.0ml，用氯仿定容至10ml量瓶中，按“1.2.3”項(xiàng)下條件重復(fù)測(cè)定5次，吸光度的RSD=2.68%(n=5)。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取10g野決明細(xì)粉5份，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制得到5份溶液，測(cè)定吸光度值，RSD=2.15%(n=5)。

2.5 加樣回收試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取10g野決明細(xì)粉5份，分別精密加入0.2mg/ml對(duì)照品溶液4.0ml按“1.2.2”項(xiàng)下方法制得5份樣品溶液。分別在紫外條件下進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得總生物堿的平均加樣回收率為98.6%，RSD=0.217%(n=5)。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證最佳工藝的準(zhǔn)確性，保證醇提工藝的合理和穩(wěn)定，按確定的提取工藝進(jìn)行平行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，野決明中總生物堿含量平均值為12.63mg/g，表明該提取工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)選出野決明中總生物堿的最優(yōu)工藝A3B2C2D2即醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1g∶15ml、提取時(shí)間1.5h、提取溫度為70℃，驗(yàn)證試驗(yàn)證明結(jié)果具有較好的重復(fù)性和精密度。