任延靖，韓 睿，趙孟良*

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué) 三江源國(guó)家農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

蕪菁(BrassicarapaL.ssp.rapa)，又稱元根、園根、盤(pán)菜[1]。起源于歐洲，即是傳統(tǒng)的栽培植物，也是青海高原特色的藥材、蔬菜及飼料兼用的塊根類(lèi)作物。在其藥用價(jià)值方面，近代藥理研究發(fā)現(xiàn)，其具有預(yù)防癌癥、抗衰老等功效[2]。在《名醫(yī)別錄》中記載：味苦溫，無(wú)毒。古代中醫(yī)書(shū)籍上綜述，助消化，祛風(fēng)，鎮(zhèn)咳，驅(qū)腹胸寒氣，解熱毒，消腫，強(qiáng)身[3]；《維吾爾藥志》記：性溫，開(kāi)胸順氣，健胃消食，解毒；用于胸悶腹胃脹痛，食欲不振，瘡癤腫毒等疾[4]?，F(xiàn)代醫(yī)藥研究表明：蕪菁內(nèi)含硫化葡萄糖苷物質(zhì)，水解后可產(chǎn)生芥子油，具有增進(jìn)食欲，促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)，幫助消化等作用[5]。近幾年來(lái)，人們已經(jīng)逐漸把對(duì)蕪菁的研究側(cè)重點(diǎn)放在了作為藥材的領(lǐng)域[6]，更多的關(guān)注其植株體內(nèi)在的化學(xué)成分，如揮發(fā)油、脂肪酸、硫苷等代謝機(jī)理及調(diào)控基因通路方面的研究。

基因表達(dá)分析作為揭示植物生命周期中基因功能和調(diào)控機(jī)制的重要手段之一。因此確保相關(guān)基因表達(dá)分析的準(zhǔn)確性十分重要[7]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)作為一種常用的檢測(cè)基因表達(dá)量的方法，具有定量準(zhǔn)確、可重復(fù)性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)[8]，廣泛應(yīng)用于基因檢測(cè)、科學(xué)研究、藥物研發(fā)與疾病診斷等領(lǐng)域[9-10]。選用表達(dá)水平不隨發(fā)育階段、組織類(lèi)型等而顯著變化的內(nèi)參基因進(jìn)行qPCR可以確保結(jié)果分析的準(zhǔn)確性[11]。因此，在使用qPCR技術(shù)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析之前，應(yīng)篩選合適的內(nèi)參基因。目前有關(guān)蕪菁不同組織適宜內(nèi)參基因篩選的研究未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以青海本地蕪菁品種‘黃金蔓菁’營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的根肉、葉片、葉柄及生殖生長(zhǎng)時(shí)期的花蕾、花、莖生葉、花莖和種子為實(shí)驗(yàn)材料，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了肌動(dòng)蛋白基因(β-actin，ACT)，親環(huán)蛋白基因(cyclophilin，CyP)，微管蛋白-a(Tub-a)，雙喹酮結(jié)合酶30(biquitin-conjugating enzyme30，UBC30)，轉(zhuǎn)錄延伸因子(elongation factor 1-alpha，EF-1-α)，雙喹酮結(jié)合酶21(biquitin-conjugating enzyme21，UBC21)，鋅指蛋白(zinc finger protein，ZNF)，TIP41蛋白(TIP41-like protein，TIP41)，三磷酸甘油醛脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，18S核糖體RNA基因(18SrRNA，18S)共10個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)情況，并采用geNorm[12]、NormFinder[13]、BestKeeper[14]和RefFinder[15]4種軟件對(duì)各候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，以期準(zhǔn)確篩選出蕪菁不同組織基因表達(dá)分析最適宜的內(nèi)參基因，為蕪菁基因組織表達(dá)分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 樣品

試驗(yàn)所用材料為青海當(dāng)?shù)厥忀计贩N“黃金蔓菁”，2019年1月育苗，3月定植于溫室內(nèi)，8月?tīng)I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期隨機(jī)取5株的根肉、葉片、葉柄及2020年4月種株留種至生殖生長(zhǎng)時(shí)期的花蕾、花、莖生葉、花莖和種子，用滅菌后的小刀切成小塊后裝于2ml無(wú)酶管，置于液氮中速凍，儲(chǔ)存于-80℃保存，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2 試劑與儀器

總RNA提取試劑盒，DL2 000 DNA Marker，PrimeScriptTMII 1stStrand cDNA Kit cDNA合成試劑盒(TaKaRa)，TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus，TaKaRa)，Eppendorf PCR儀(德國(guó))，Eppendorf 離心機(jī)(德國(guó))，超低溫冰箱，NanoDrop2000核酸檢測(cè)儀。

2 方法

2.1 總RNA提取與cDNA合成

按照植物總RNA提取試劑盒操作提取總RNA，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，采用NanoDrop2000檢測(cè)儀測(cè)定其濃度和純度，A260/A280在1.9-2.0之間，RNA的總體質(zhì)量較好。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 候選內(nèi)參基因的引物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

在ICG(http://icg.big.ac.cn/index.php/Main_Page)中以十字花科作物為參照選擇10個(gè)候選內(nèi)參基因，使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)特異引物。內(nèi)參基因的特異引物見(jiàn)表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。在實(shí)時(shí)熒光定量中，通過(guò)溶解曲線判斷引物的特異性，若溶解曲線為單峰說(shuō)明引物特異性好。

表1 qRT-PCR中內(nèi)參基因的引物序列Table.1 Primer sequence of internal reference gene in qRT-PCR

2.3 內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR

熒光定量PCR參照LightCycler/LightCycler 480 System的操作方法。在冰上配置反應(yīng)體系為20ul，包含10ul TB Green Premix Ex Taq II(Ti RNaseH Plus)，上、下游引物各0.8ul，2ul cDNA，ddH2O 6.4ul。qRT-PCR反應(yīng)程序依次為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火和延伸30s，40個(gè)循環(huán)。最后溶解曲線分析：95℃ 5s，65℃ 60s，95℃ 5s。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

通過(guò)qRT-PCR對(duì)參試樣品的cDNA進(jìn)行檢測(cè)，使用LightCycle?480II PCR定量分析儀自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到各樣品的Ct，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入geNorm，NormFinder，BestKeeper中并通過(guò)Delta CT法分析各內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，同時(shí)利用RefFinder對(duì)各內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，篩選出蕪菁不同組織中基因表達(dá)分析的最適內(nèi)參基因。

3 結(jié)果與分析

3.1 內(nèi)參基因引物特異性及擴(kuò)增效率分析

以不同部位的cDNA為模板，對(duì)10個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，其中18SrRNA和GAPDH無(wú)結(jié)果，舍棄。如表2所示，對(duì)剩下的8個(gè)參考基因的qRT-PCR的擴(kuò)增效率(E)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從ACT和CyP的98.9%到EF-1-a的99.3%不等，相關(guān)系數(shù)(r)范圍從Tub-a的0.836到ACT和CyP的0.972。溶解曲線分析結(jié)果還表明8個(gè)引物擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于單個(gè)片段，均只有明顯的單一峰值，無(wú)發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體等非特異性擴(kuò)增(圖1)，進(jìn)一步說(shuō)明引物特異性好。

表2 qRT-PCR分析中8個(gè)內(nèi)參基因特異性引物參數(shù)Table.2 Specific primer parameters of 8 internal reference genes in RT-PCR analysis

圖1 蕪菁候選內(nèi)參基因的qRT-PCR溶解曲線Fig.1 Melting curves of candidate internal reference genes for qRT-PCR analysis in Brassica rapa L.ssp.rapa

3.2 內(nèi)參基因的表達(dá)譜分析

對(duì)各樣品中8個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平(Ct)進(jìn)行了分析，其中Ct越小表明該基因表達(dá)水平越高，且同一候選基因在不同部位中的Ct的變化反應(yīng)了該基因的穩(wěn)定性，變化越小表明該基因越穩(wěn)定。各候選內(nèi)參基因在不同樣品中的平均Ct介于21.61-27.31，其中以CyP平均Ct最小，為21.61，表明其表達(dá)水平最高，ZNF的平均Ct最高，為27.31，表明其在各個(gè)樣品中表達(dá)水平最低。按照Ct值的大小可以看出8個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)由高到低依次為CyP、UBC30、ACT、EF-1-a、UBC21、Tub-a、TIP41、ZNF。此外，TIP41基因的Ct變化范圍最小為9.03，其次是UBC30，ΔCt為9.91，變化范圍最大的EF-1-a和ZNF，ΔCt為35，由于此值超出了熒光定量分析的最大臨界值，故EF-1-a和ZNF不適合作為蕪菁的內(nèi)參基因，舍棄。

3.3 不同組織內(nèi)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

3.3.1 geNorm分析

利用geNorm程序?qū)Ω魇Ｏ碌?個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，通過(guò)計(jì)算基因的表達(dá)穩(wěn)定值(M)，對(duì)基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排序，M越小，表明基因的穩(wěn)定性越高。結(jié)果表明，蕪菁不同部位中內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定由高到低依次為UBC21/TIP41>UBC30>ACT>Tub-a>CyP，即UBC21和TIP41的表達(dá)最為穩(wěn)定，CyP的穩(wěn)定性最差(圖2)。

圖2 geNorm 分析內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性Fig.2 Analysis of expression stability of internal reference genes by geNorm

3.3.2 NormFinder分析

通過(guò)NormFinder程序分析這6個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，穩(wěn)定值越小的基因的表達(dá)越穩(wěn)定。穩(wěn)定性排序?yàn)門(mén)IP41>ACT>Tub-a>UBC30>UBC21>CyP，根據(jù)NormFinder的分析結(jié)果，TIP41為最優(yōu)內(nèi)參基因，與geNorm分析結(jié)果一致。

3.3.3 BestKeeper分析

BestKeeper是一種基于原始的Ct值來(lái)評(píng)價(jià)內(nèi)參基因穩(wěn)定性的軟件。通過(guò)BestKeeper軟件得到2個(gè)指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)差(SD)、變異系數(shù)(CV)，SD和CV值越小，內(nèi)參基因越穩(wěn)定。由分析結(jié)果可知(表3)，6個(gè)候選基因中SD值最小的是TIP41(0.82)，其次是UBC21(0.96)；CV值最小的是TIP41(0.03)，其次是UBC21(0.04)。SD值低于1.0被認(rèn)為表達(dá)穩(wěn)定。對(duì)于ACT、CyP、UBC30及Tub-a的SD值均高于1.0，所以表達(dá)不穩(wěn)定，排除，而UBC21和TIP41的SD值均低于1.0，且TIP41的SD值低于UBC21的，故TIP41最穩(wěn)定，這也與前兩種分析方法得到的結(jié)果一致。

3.3.4 RefFinder分析

RefFinder可以綜合geNorm、NormFinder、BestKeeper 3種算法，列出6個(gè)候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性排名。對(duì)所有樣品進(jìn)行分析，穩(wěn)定性排名前兩位的內(nèi)參基因分別為T(mén)IP41和UBC21。

4 討論與結(jié)論

蕪菁作為藥、食、飼三用的高原蔬菜作物，具有極高的研究?jī)r(jià)值，尤其在藥用價(jià)值方面，目前針對(duì)蕪菁藥用價(jià)值的研究主要集中在化學(xué)成分[16]，海仁古麗·麥麥提等人[17]的研究還表明蕪菁還富含中藥多糖，有助于降低血糖的作用[18]。蕪菁作為一種中藥材具有極大的發(fā)展前景，今后對(duì)其活性成分的提取將成為熱點(diǎn)，然而按照傳統(tǒng)從原料藥中提取活性成分的方法受到供試材料的藥用成分活性低等因素的限制很難滿足市場(chǎng)需求[19]。因此，利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段來(lái)研究植物體內(nèi)有效成分合成代謝的遺傳基礎(chǔ)和分子調(diào)控機(jī)制，探究具有藥用價(jià)值的植物體內(nèi)活性成分的生物合成途徑已日漸成為了今后滿足人們對(duì)活性成分需求的最重要的有效途徑之一。蕪菁植株體內(nèi)富含多種活性物質(zhì)，如黃酮[20-21]、皂苷[22]、揮發(fā)油[23]等，未來(lái)可被廣泛應(yīng)用于保健品、藥品等領(lǐng)域。然而，對(duì)其大部分活性成分合成途徑的分子基礎(chǔ)和遺傳調(diào)控機(jī)制仍不清楚，生物合成途徑中涉及的關(guān)鍵酶基因功能也有待進(jìn)一步的研究。qPCR作為生物領(lǐng)域中分析基因表達(dá)的常用技術(shù)之一，被廣泛的應(yīng)用在植物次生代謝產(chǎn)物的分子機(jī)制研究等領(lǐng)域[24-25]。為了確保目的基因表達(dá)分析結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，在qPCR數(shù)據(jù)處理過(guò)程中需要引入合適的內(nèi)參基因以校正不同樣品間由于RNA的提取效率、質(zhì)量以及反轉(zhuǎn)錄效率的不同而導(dǎo)致的誤差[26]。據(jù)報(bào)道，在一些植物中也已開(kāi)展了相關(guān)內(nèi)參基因篩選的研究，在鈍裂銀蓮花不同部位中以UBQ表現(xiàn)最穩(wěn)定，而β-TUB相對(duì)穩(wěn)定性最差[27]；在肉桂和大葉清化桂兩種植物的皮、枝、葉不同部位最適的內(nèi)參基因?yàn)镚APDH[28]；西紅花qRT-PCR分析的合適內(nèi)參基因?yàn)镚APDH和UBQ，可用于種球發(fā)育、花發(fā)育、次生代謝產(chǎn)物形成和積累等機(jī)理研究[29]；在藥用植物老鴉瓣中，UBC和UBI均適合作為其不同器官和芽莖不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因[30]；梁晴等[31]人對(duì)中藥材植物川續(xù)斷植物的內(nèi)參基因進(jìn)行了研究，結(jié)果表明DaACT103和DaTUB5均可作為川續(xù)斷的內(nèi)參基因。以上研究說(shuō)明了不同植物不同部位及不同的發(fā)育階段下，基因表達(dá)分析的最適內(nèi)參基因的表達(dá)不同，這也進(jìn)一步證明篩選內(nèi)參基因的重要性。

本試驗(yàn)通過(guò)geNorm，NormFinder，BestKeeper法分析得出的最穩(wěn)定的蕪菁內(nèi)參基因結(jié)果一致，以TIP41基因表達(dá)最為穩(wěn)定，其次為UBC21。RelFinder綜合了以上3種分析結(jié)果，同樣綜合得出以TIP41基因最為穩(wěn)定。因此，TIP41可作為研究蕪菁不同組織基因表達(dá)的理想內(nèi)參基因。