郭小華，葉民珠，吳龍火

（贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000）

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是在全球盛行的一種關(guān)節(jié)退行性疾病，且隨著老齡化發(fā)展及不健康飲食導(dǎo)致的肥胖人群的增加，發(fā)病率不斷攀升，因此也被稱為老年性關(guān)節(jié)炎或肥胖性關(guān)節(jié)炎［1-2］。骨關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)以關(guān)節(jié)腫痛、骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)功能受限等居多［3］，其發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制尚不很明確，多數(shù)報(bào)道稱可能與年齡、肥胖、遺傳或過度勞累有關(guān)［4］。近年來，對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制研究逐漸進(jìn)入分子水平，很多炎癥靶點(diǎn)如TNF-α、IL-1、NF-κB等被認(rèn)為與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［5-7］。鄭文浩等［8］研究發(fā)現(xiàn)，中藥活性成分漆黃素（Fisetin，非瑟酮）能夠抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的多種炎癥因子的過度表達(dá)，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗骨關(guān)節(jié)炎活性。

漆黃素（3，7，3’，4’-四羥基黃酮）是一種植物中天然存在的多酚黃酮類化合物，主要從漆科植物漆樹、木蠟樹和黃櫨中提取分離得到，也存在于一些蔬菜、水果中［9-12］。漆黃素藥理作用廣泛，主要表現(xiàn)出抗氧化、抗炎、降糖、抗腫瘤等［13］，在抗炎作用方面的研究較多、較深入［14-16］。有研究表明，漆黃素可降低NO、PGE2、TNF-α等10個(gè)炎癥因子的表達(dá)，抑制IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而阻止骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展［8］。

然而，漆黃素產(chǎn)生抗骨關(guān)節(jié)炎作用時(shí)，降低炎癥因子表達(dá)的具體作用機(jī)制如何？對各種炎癥因子的抑制作用是否具有選擇性？這些問題目前有待于進(jìn)一步深入研究。本課題組之前探討過黃酮類化合物通過抑制炎癥因子表達(dá)產(chǎn)生抗骨關(guān)節(jié)炎的作用［17］，基于此，本文嘗試用分子對接的方法，模擬漆黃素與NO等10個(gè)抗骨關(guān)節(jié)炎靶蛋白的相互作用，探討漆黃素抗骨關(guān)節(jié)炎可能的作用機(jī)制，并結(jié)合漆黃素與靶蛋白的結(jié)合模式，推測漆黃素結(jié)構(gòu)修飾的方向，為獲得活性更高的漆黃素衍生物提供一定思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料AutoDock 4.2、AutoDock Tools 1.5.4軟件可從官網(wǎng)（http：//autodock.scripps.edu/）下載，各靶蛋白（受體）的晶體結(jié)構(gòu)可從PDB數(shù)據(jù)庫中下載，其他應(yīng)用軟件及在線程序均可在其各自官網(wǎng)下載或直接應(yīng)用，所需軟件、在線程序及其用途見表1。

表1 對接實(shí)驗(yàn)使用的軟件、在線程序及用途

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分子對接計(jì)算前配體和受體的預(yù)處理

1.2.1.1 配體的選取及預(yù)處理本文以漆黃素及10個(gè)抗骨關(guān)節(jié)炎靶蛋白（受體）中的原始配體為分子對接實(shí)驗(yàn)的配體（化合物1~11，圖1）。先將11個(gè)配體的平面結(jié)構(gòu)在線轉(zhuǎn)化成三維結(jié)構(gòu)，并在Chimera程序中將其分別置于相應(yīng)對接受體的活性位點(diǎn)處，保存為pdb格式文件。再將此pdb格式文件的配體分子置于AutoDockTools（ADT）軟件中，加上電荷和非極性氫，保存為pdbqt格式文件。

圖1 漆黃素等11個(gè)配體化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2.1.2 受體的選取及預(yù)處理從Brookheaven蛋白數(shù)據(jù)庫中獲取10個(gè)受體的晶體結(jié)構(gòu)，并在Chimera程序中將受體中的水分子、原始配體等剔除，保存為pdb格式文件。再將此pdb格式文件的受體分子置于ADT軟件中加上電荷和非極性氫，保存為pdbqt格式文件，如受體中有金屬離子缺少電荷，可在Python 2.5.2軟件中為其添加電荷并保存。

1.2.2 分子對接實(shí)驗(yàn)運(yùn)算在ADT軟件中，以配體為中心，設(shè)置配體分子和受體分子的網(wǎng)格大?。?0?×60?×60?），配體構(gòu)象搜索過程使用半經(jīng)驗(yàn)打分函數(shù)和拉馬克遺傳算法，算法對接的輪數(shù)設(shè)為100，其他參數(shù)保持默認(rèn)值，運(yùn)行AutoGrid生成必要的圖像文件，最后再運(yùn)行ADT中的autogrid和autodock對接程序，進(jìn)行分子對接計(jì)算實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 分子對接實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理以估計(jì)抑制常數(shù)（Inhibit constant，Ki）和結(jié)合自由能（Binding energy，△Gbind）為參考指標(biāo)，以各受體中的原始配體為對照，比較漆黃素與各受體分子對接的Ki值和△Gbind值，并從最佳構(gòu)象上分析各對接配體與相應(yīng)受體的結(jié)合模式，從分子水平探討它們的結(jié)合作用。

2 結(jié)果

漆黃素與10個(gè)受體的原始配體與對應(yīng)受體的分子對接數(shù)據(jù)Ki值和△Gbind值見表2?！鱃bind、Ki越小，說明與受體的結(jié)合能力越強(qiáng)，對受體的虛擬抑制活性越強(qiáng)。從對接數(shù)據(jù)上看，漆黃素與各受體對接的Ki值均達(dá)到了微摩爾級水平，表現(xiàn)出對各受體不同程度的抑制作用。

表2 配體分子與各靶點(diǎn)分子對接實(shí)驗(yàn)的對接數(shù)據(jù)

3 討論

3.1 分子對接數(shù)據(jù)分析由表2的對接數(shù)據(jù)可以看出，漆黃素與NO、IL-6、TNF-α及MMP-3等4個(gè)受體對接的Ki值均小于相應(yīng)原始配體重對接的Ki值，尤其是與TNF-α受體的對接Ki值最小，為7.10×10-2μmol·L-1，遠(yuǎn)小于相應(yīng)原始配體的對接Ki值（5.27×10-1μmol·L-1），表現(xiàn)出對該受體很強(qiáng)的虛擬抑制活性。漆黃素與PGE2等6個(gè)受體分子對接Ki值均高于相應(yīng)原始配體的對接Ki值，特別是與iNOS受體對接的Ki值為2.54μmol·L-1，是其相應(yīng)原始配體對接Ki值（7.16×10-2μmol·L-1）的35倍，對iNOS受體的虛擬抑制活性要明顯弱于相應(yīng)的原始配體。

從對接數(shù)據(jù)上看，漆黃素與TNF-α等4個(gè)受體的結(jié)合作用，要強(qiáng)于其與iNOS等6個(gè)受體結(jié)合作用。由此可見，漆黃素對LPS誘導(dǎo)的多種炎癥因子表達(dá)的抑制作用有一定的選擇性。TNF-α等蛋白可能是漆黃素發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)炎的主要作用靶點(diǎn)。

為探討漆黃素對受體的選擇性，我們將從分子對接構(gòu)象上比較分析漆黃素與TNF-α受體和iNOS受體結(jié)合作用的強(qiáng)弱，并嘗試提出漆黃素可能的結(jié)構(gòu)修飾方向，以期獲得抗骨關(guān)節(jié)炎活性更高的漆黃素衍生物。

3.2 分子對接構(gòu)象分析

3.2.1 漆黃素、原始配體6與TNF-α受體對接構(gòu)象分析TNF-α是腫瘤壞死因子中的一種類型，可促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。從晶體結(jié)構(gòu)可看出，TNF-α受體的活性位點(diǎn)是由LEU350、HIS409、TYR436、GLU398等十幾個(gè)氨基酸構(gòu)成的一條狹長的活性腔。該活性腔有3個(gè)活性口袋，由GLY349、HIS409、HIS415等氨基酸構(gòu)成的親水性口袋，和分別由VAL440、LEU401、GLU398及由TYR436、PRO437、ALA439等氨基酸構(gòu)成的2個(gè)疏水性口袋（疏水性口袋1和疏水性口袋2）（圖2）。

分子對接實(shí)驗(yàn)構(gòu)象顯示（圖2），漆黃素和原始配體6兩個(gè)分子均橫跨了TNF-α受體的整個(gè)活性腔，并占據(jù)了活性腔中親水性口袋和疏水性口袋1。

圖2 漆黃素、原始配體6與TNF-α受體對接最佳構(gòu)象圖

漆黃素的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)和原始配體6的羥胺結(jié)構(gòu)嵌入到了活性腔的親水性口袋，其中漆黃素的鄰二酚羥基與親水性口袋中的關(guān)鍵氨基酸GLY349形成了兩個(gè)氫鍵相互作用力，原始配體6的羥胺與親水性口袋中的關(guān)鍵氨基酸HIS415形成了一個(gè)氫鍵相互作用力。

漆黃素的黃酮母核結(jié)構(gòu)及原始配體6的丁炔氧基部分則伸入到活性腔中的疏水性口袋1，形成一定的疏水相互作用力，同時(shí)漆黃素黃酮母核上的酚羥基還與疏水性口袋1中的GLU398氨基酸形成了一個(gè)氫鍵相互作用力。

漆黃素和原始配體6在空間上能夠與TNF-α受體相互匹配，對接構(gòu)象穩(wěn)定，并通過與活性口袋的關(guān)鍵氨基酸形成氫鍵等相互作用力，表現(xiàn)出與TNF-α受體很強(qiáng)的結(jié)合能力。與分子對接數(shù)據(jù)相吻合，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗骨關(guān)節(jié)炎的虛擬活性。不足的是，漆黃素和原始配體6在空間上均未能靠近疏水性口袋2。

3.2.2 漆黃素、原始配體7與iNOS受體對接構(gòu)象分析蛋白晶體結(jié)構(gòu)顯示，iNOS受體的活性位點(diǎn)由一條細(xì)長的活性腔和一個(gè)圓形活性口袋組成。其中 細(xì) 長 的 活 性 腔 由MET349、TYR483、CYS194、PHE363等氨基酸構(gòu)成，而圓形活性口袋則由PHE363、ALA345、GLU257等氨基酸構(gòu)成（圖3）。

圖3 漆黃素、原始配體7與iNOS受體對接最佳構(gòu)象圖

從分子對接數(shù)據(jù)我們已知，漆黃素與iNOS受體的對接數(shù)據(jù)劣于原始配體7，原因可能是類似平面結(jié)構(gòu)的漆黃素在與iNOS受體結(jié)合時(shí)，只能占據(jù)活性位點(diǎn)的細(xì)長活性腔，而不能伸入到圓形活性口袋（圖3）。另外，漆黃素母核中苯環(huán)結(jié)構(gòu)有一定的疏水性，可能導(dǎo)致苯環(huán)上的酚羥基很難與活性腔中的一些極性氨基酸形成氫鍵，僅黃酮母核上的羰基氧與CYS194氨基酸形成了一個(gè)氫鍵相互作用力。

與漆黃素不同的是，多環(huán)相連接的原始配體7兩端的極性基團(tuán)分別與活性腔中的TRP188和TYR483氨基酸形成了兩個(gè)氫鍵相互作用力。此外，原始配體7扭曲的空間結(jié)構(gòu)還使得中間連接的哌啶結(jié)構(gòu)向iNOS受體的圓形活性口袋靠近，雖未完全占據(jù)整個(gè)活性口袋，但仍形成了一定的相互作用力，導(dǎo)致原始配體7與iNOS受體的結(jié)合作用要明顯強(qiáng)于漆黃素，分子對接數(shù)據(jù)明顯優(yōu)于漆黃素也在情理之中。

3.2.3 漆黃素潛在的結(jié)構(gòu)修飾方向探討從漆黃素與TNF-α受體和iNOS受體的分子對接構(gòu)象分析，漆黃素?zé)o論是與結(jié)合作用強(qiáng)的TNF-α受體，還是與虛擬活性較差的iNOS受體對接時(shí)，都未能完全匹配占據(jù)相應(yīng)蛋白的所有活性位點(diǎn)。漆黃素與TNF-α受體結(jié)合時(shí)，沒有占據(jù)疏水性口袋2，與iNOS受體對接時(shí)，遠(yuǎn)離了圓形活性口袋，這都表明漆黃素在抗骨關(guān)節(jié)炎活性方面有結(jié)構(gòu)修飾的空間，本課題組在這方面做了一些嘗試。

根據(jù)漆黃素與TNF-α受體和iNOS受體的相互作用和結(jié)合方式，我們提出在漆黃素黃酮母核的3位羥基上引入芳香性基團(tuán)或極性取代芳香性基團(tuán)（圖4），可增強(qiáng)漆黃素與周邊氨基酸的共軛效應(yīng)或疏水作用力，提高漆黃素與相應(yīng)蛋白的結(jié)合能力，以提高其抗骨關(guān)節(jié)炎活性。通過分子對接實(shí)驗(yàn)，我們這一設(shè)想也得到了驗(yàn)證。合成所設(shè)計(jì)的漆黃素衍生物，并進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)，是我們下一步的研究任務(wù)。

圖4 漆黃素與TNF-α受體、iNOS受體結(jié)合時(shí)潛在的結(jié)構(gòu)修飾方向示意圖

4 結(jié) 論

分子對接的Ki值和△Gbind值是分子對接技術(shù)對配體與受體對接結(jié)果最直接的評價(jià)，Ki值和△Gbind值越小，配體與受體的結(jié)合作用越強(qiáng)，配體對受體的虛擬抑制活性越高。分子對接構(gòu)象可更直觀地體現(xiàn)配體與受體的結(jié)合模式，對接構(gòu)象越穩(wěn)定，配體與受體結(jié)合越牢固。

本研究以原始配體為對照，模擬了漆黃素與10個(gè)抗骨關(guān)節(jié)炎靶蛋白的相互作用。結(jié)果表明，漆黃素對抗骨關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)的結(jié)合作用有一定的選擇性。漆黃素與TNF-α受體對接的Ki值和△Gbind值最小，且遠(yuǎn)小于相應(yīng)原始配體的Ki值和△Gbind值。分子對接實(shí)驗(yàn)時(shí)，漆黃素在空間上與TNF-α受體的活性位點(diǎn)相互匹配，其結(jié)構(gòu)中的3個(gè)酚羥基均與受體活性位點(diǎn)中的關(guān)鍵氨基酸形成了氫鍵相互作用力，分子對接構(gòu)象穩(wěn)定，表現(xiàn)出與TNF-α受體很強(qiáng)的結(jié)合作用及很強(qiáng)的虛擬抑制活性。

漆黃素與iNOS受體的對接數(shù)據(jù)不理想，對接Ki值是其相應(yīng)原始配體的35倍，漆黃素與iNOS受體分子對接時(shí)，只占據(jù)了iNOS受體的細(xì)長活性腔，對圓形活性口袋作用較弱。漆黃素對iNOS等受體的虛擬抑制活性弱于其相應(yīng)原始配體。

漆黃素與TNF-α受體的對接數(shù)據(jù)最優(yōu)，對接構(gòu)象最穩(wěn)定，TNF-α可能是漆黃素發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)炎作用的主要靶點(diǎn)。在漆黃素3位羥基引入芳香性取代基團(tuán)，有利于增強(qiáng)漆黃素與相應(yīng)受體的結(jié)合能力，是漆黃素提高其抗骨關(guān)節(jié)炎活性的主要結(jié)構(gòu)修飾位點(diǎn)。本研究借助分子對接軟件模擬漆黃素與靶蛋白的作用模式，為中藥活性成分的抗炎作用機(jī)制及結(jié)構(gòu)修飾提供了新的思路。