蘇章庭 曾曉琮 劉單單 楊丹婷 周露

（廣東省食品檢驗(yàn)所 廣東廣州 510435）

1 前言

大腸菌群（coliform group、coliform）是指一群需氧及兼性厭氧、能在37℃培養(yǎng)24 h內(nèi)使乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性、無芽胞桿菌。它基本包括糞便內(nèi)所有的兼性厭氧、革蘭氏陰性的桿菌，典型的菌屬包括埃希氏菌屬（Escherichia）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、腸 桿 菌 屬（Enterobacter）、克 雷 伯 氏 菌 屬（Klebsiella）、哈夫尼菌屬（Hafnia）等。但大腸菌群不是分類學(xué)上的命名，而僅作為一個(gè)工作定義[1-7]。

多管發(fā)酵法是根據(jù)大腸菌群細(xì)菌能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣以及具備革蘭氏染色陰性、無芽孢、呈桿狀等有關(guān)特性，通過系列稀釋實(shí)驗(yàn)與結(jié)合概率理論，來估計(jì)水樣中的總大腸茵群數(shù)。在一般的多管發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，樣品需要先經(jīng)過梯度系列稀釋，再取一定體積的水樣接種至液體培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度通常需要進(jìn)行多組平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。然后根據(jù)培養(yǎng)過后的陽性管數(shù)，通過查閱MPN統(tǒng)計(jì)表估計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[8-10]。

多管發(fā)酵法的結(jié)果以最可能數(shù)（Most Probable Number，MPN）來進(jìn)行表示。實(shí)際上是根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)理論，估計(jì)水體中的大腸菌群密度的一種方法。如果從理論方面考慮，并且進(jìn)行最大的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)這種估計(jì)有大于實(shí)際數(shù)字的傾向，但是只要每一稀釋度試管重復(fù)數(shù)目增加，這種差異便會(huì)減少。所以對(duì)于細(xì)菌含量的估計(jì)值，大部分取決于那些既顯示陽性又顯陰性的稀釋度。因此，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，水樣檢驗(yàn)所要求的平行實(shí)驗(yàn)數(shù)目，需根據(jù)所要求數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度而定[11]。對(duì)于直接飲用的如礦泉水等預(yù)計(jì)不是嚴(yán)重污染的樣品，可以采用單個(gè)稀釋度作為預(yù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于稀釋管中培養(yǎng)基的體積和平行數(shù)目應(yīng)當(dāng)根據(jù)水中預(yù)期的細(xì)菌密度和計(jì)劃的稀釋系列梯度而變化。

對(duì)于礦泉水水質(zhì)中大腸菌群的檢驗(yàn)，《GB 8538—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》[12]采用5管法（使用5管10 mL乳糖膽鹽培養(yǎng)基分別接種10mL水樣）進(jìn)行檢驗(yàn)；世界衛(wèi)生組織（Wrold Health Organization，WHO）《水質(zhì)監(jiān)測(cè)—淡水水質(zhì)研究和監(jiān)測(cè)計(jì)劃的設(shè)計(jì)和實(shí)施實(shí)用指南》[13]中“第十章：微生物分析檢測(cè)”采用6管法（使用1管50 mL乳糖膽鹽培養(yǎng)基接種50 mL水樣，5管10 mL乳糖膽鹽培養(yǎng)基分別接種10 mL水樣）。為了比較這2種方法的性能，本文采用不同的菌株，設(shè)計(jì)不同的濃度對(duì)這2種方法進(jìn)行驗(yàn)證。

2 材料與方法

2.1 儀器、試劑與菌株

儀器：濁度儀（DensiCHEK plus，生物梅里埃中國(guó)）；MS3漩渦混合器（IKA儀器設(shè)備有限公司）；移液器（eppendorf中國(guó)）；Masticator均質(zhì)器（IUL）；SX-700高壓滅菌鍋（日本TOMY公司）；PL6001E電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；LRH-250F生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；AC2-4S1生物安全柜（新加坡ESCO公司）；Milli-Q Reference超純水機(jī)（默克化工技術(shù)有限公司）。

試劑：PBS緩沖液、乳糖膽鹽培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯（均由北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)）。

菌株：大腸埃希氏菌ATCC 25922，產(chǎn)氣腸桿菌ATCC 13048，弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864，糞鏈球菌ATCC 29212。

2.2 方法

2.2.1 測(cè)試菌株與濃度選擇

按照《GB 4789.28—2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》[14]以及《SN/T 3266—2012食品微生物檢驗(yàn)方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》[15]關(guān)于生長(zhǎng)率、選擇性和特異性的要求，選取了大腸埃希氏菌ATCC 25922、產(chǎn)氣腸桿菌ATCC 13048、弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864以及混合菌（大腸埃希氏菌ATCC 25922+產(chǎn)氣腸桿菌ATCC 13048+弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864+糞鏈球菌ATCC 29212）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基為乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液。

弗氏檸檬酸桿菌是檸檬酸桿菌屬的模式種[16]。產(chǎn)氣腸桿菌原本在腸桿菌屬下，但是在最新的分類中已經(jīng)劃分到克雷伯菌屬下[17]。兩者均為大腸菌群中典型菌屬的成員。大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌和弗氏檸檬酸桿菌在乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液中的典型生長(zhǎng)現(xiàn)象為產(chǎn)酸產(chǎn)氣?；旌暇旱闹饕饔檬悄M競(jìng)爭(zhēng)菌群，競(jìng)爭(zhēng)菌群的存在使微生物檢驗(yàn)更符合實(shí)際和更具挑戰(zhàn)性。加入競(jìng)爭(zhēng)菌群可使食品樣品最接近于自然狀態(tài)，其足以證實(shí)某類食品中目標(biāo)微生物的部分回收率。

《SN/T 3266—2012食品微生物檢驗(yàn)方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》中，關(guān)于人工污染的食品樣品，要求有高、中、低3個(gè)接種水平（例如，102CFU/g～103CFU/g、104CFU/g、105CFU/g）和一個(gè)未接種對(duì)照。對(duì)每個(gè)接種水平和陰性對(duì)照，都要用待確認(rèn)方法和基準(zhǔn)方法各檢測(cè)5個(gè)樣品。低接種水平應(yīng)設(shè)定在接近檢測(cè)限，中、高接種水平應(yīng)當(dāng)分別高1和2個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。如有必要，可加做中間水平以提高精密度。

將各個(gè)測(cè)試菌株分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中，過夜培養(yǎng)。

2.2.2 混合菌液制作

混合菌液由大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌和高一個(gè)濃度水平的糞鏈球菌組成，制作比例見表1。

表1 不同濃度實(shí)驗(yàn)的混合菌比例

2.2.3 梯度系列稀釋

將經(jīng)過培養(yǎng)的菌液稀釋到0.58±0.02麥?zhǔn)蠞岫龋谱鳛?08濃度。在此基礎(chǔ)上作梯度系列稀釋，并制作100CFU/100mL，101CFU/100mL，102CFU/100 mL濃度的測(cè)試水樣。

2.2.4 接種

將3個(gè)水平濃度的測(cè)試菌株水樣分別進(jìn)行6管法和5管法試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。

6管法：每個(gè)陽性污染濃度的水樣取50 mL接種到盛有50 mL雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液的100 mL試管，接種1份；再取10 mL接種到盛有10 mL雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液的試管中，共接種5份。每個(gè)稀釋度做7個(gè)平行。

MPN值按照世界衛(wèi)生組織（Wrold Health Organization，WHO）《水質(zhì)監(jiān)測(cè)—淡水水質(zhì)研究和監(jiān)測(cè)計(jì)劃的設(shè)計(jì)和實(shí)施實(shí)用指南》第十章：微生物分析檢測(cè)中的MPN統(tǒng)計(jì)表進(jìn)行驗(yàn)證。具體見表2。

表2 用1管50 mL和5管10 mL水樣時(shí)各種陽性和陰性結(jié)果組合的MPN值及其95%可信限

5管法：每個(gè)陽性污染濃度的水樣取10 mL接種到盛有10 mL雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)液的試管中，共接種5份。每個(gè)稀釋度做7個(gè)平行。

MPN值按照《GB 8538—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》中55.1.2.5.1的MPN統(tǒng)計(jì)表進(jìn)行驗(yàn)證。具體見表3。

表3 用5管10 mL水樣時(shí)各種陽性和陰性結(jié)果組合的MPN值及其95%可信限

3 結(jié)果

3.1 高濃度實(shí)驗(yàn)

102CFU/100mL濃度的陽性菌（產(chǎn)氣腸桿菌、大腸埃希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、混合菌）污染試驗(yàn)，6管法與5管法試驗(yàn)現(xiàn)象均為所有實(shí)驗(yàn)管產(chǎn)酸產(chǎn)氣。符合大腸菌群細(xì)菌能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的生化特性。

3.2 中濃度實(shí)驗(yàn)

101CFU/100mL濃度的陽性菌（產(chǎn)氣腸桿菌、大腸埃希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、混合菌）污染試驗(yàn)結(jié)果均大于0MPN/100mL。對(duì)于MPN值計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果沒有明顯差異。具體見表4。

表4 6管法與5管法的標(biāo)準(zhǔn)偏差

3.3 低濃度實(shí)驗(yàn)

100CFU/100mL濃度的陽性菌（產(chǎn)氣腸桿菌、大腸埃希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、混合菌）污染試驗(yàn)，6管法與5管法試驗(yàn)結(jié)果存在不同。其中：

（1）產(chǎn)氣腸桿菌污染試驗(yàn)6管法試驗(yàn)出現(xiàn)4次結(jié)果為＜1MPN/100 mL，5管法試驗(yàn)出現(xiàn)5次結(jié)果為0MPN/100 mL。

（2）大腸埃希氏菌污染試驗(yàn)6管法試驗(yàn)出現(xiàn)1次結(jié)果為＜1MPN/100 mL，5管法試驗(yàn)出現(xiàn)3次結(jié)果為0MPN/100 mL。

（3）弗氏檸檬酸桿菌污染試驗(yàn)6管法試驗(yàn)出現(xiàn)2次結(jié)果為＜1MPN/100 mL，5管法試驗(yàn)出現(xiàn)3次結(jié)果為0MPN/100 mL。

（4）混合菌污染試驗(yàn)6管法試驗(yàn)未出現(xiàn)結(jié)果為＜1MPN/100 mL，5管法試驗(yàn)出現(xiàn)3次結(jié)果為0MPN/100 mL。

本次試驗(yàn)具體結(jié)果見表5。

表5 多管稀釋法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（續(xù)表5）

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在高濃度水平下，所有實(shí)驗(yàn)管均能夠表現(xiàn)出產(chǎn)酸產(chǎn)氣的典型大腸菌群生化特性。在中濃度水平下，結(jié)合多個(gè)平行試驗(yàn)結(jié)果，5管法和6管法的數(shù)據(jù)離散程度未表現(xiàn)出較大差異。在低濃度試驗(yàn)中，6管法比5管法表現(xiàn)出了更高的靈敏度。

6管法加樣量為100 mL，客觀上更符合結(jié)果報(bào)告為“MPN/100 mL”。5管法加樣量為50 mL，結(jié)果報(bào)告為“MPN/100 mL”，該種結(jié)果報(bào)告的單位是理論上的單位體積濃度而并不能體現(xiàn)實(shí)際檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)體積。所以，在客觀上6管法采樣體積更加符合MPN的結(jié)果描述。

根據(jù)參考的MPN表，將可以計(jì)算出置信區(qū)間的MPN值繪制出區(qū)間圖。通過圖1和圖2的區(qū)間圖的比較，6管法比5管法能夠表現(xiàn)出更多的結(jié)果，即具有更好的精確度。從誤差區(qū)間上看，6管法比5管法有更高的準(zhǔn)確度。

圖1 6管法部分MPN值區(qū)間圖

圖2 5管法部分MPN值區(qū)間圖

5 討論

5.1 多組MPN的平均值

對(duì)于多組發(fā)酵管的MPN平均值，應(yīng)該根據(jù)各組發(fā)酵管的呈陽性反應(yīng)管數(shù)的平均值來計(jì)算MPN值，不能直接取各組MPN值的平均數(shù)[18]。

對(duì)于中濃度計(jì)算MPN平均值。對(duì)于5管法，可以使用以下公式求解：

其中：n代表實(shí)驗(yàn)總試管數(shù)量；r代表培養(yǎng)后陽性試管數(shù)量；v代表接種體積；λ代表細(xì)菌密度。

對(duì)于6管法，設(shè)10 mL管的陽性管數(shù)量為r1，陰性管數(shù)量為r2，50 mL管的陽性管數(shù)量為r3，陰性管數(shù)量為r4?？傻茫?/p>

按最大似然方法求解MPN值[19-23]。

5.2 MPN的標(biāo)準(zhǔn)差與置信區(qū)間[24-26]

對(duì)于MPN的方差可以通過MPN計(jì)算公式的二階微分方程求出：

其中：k表示稀釋數(shù)；x表示陽性管數(shù)；d表示稀釋因子；w表示接種量；λ表示細(xì)菌密度。

在以往的許多研究中，由于每管稀釋液可能只含有少量樣品。在這種情況下，MPN的分布會(huì)非常偏斜，而lgMPN的分布更接近對(duì)稱。因此建議從lgMPN而非直接從MPN進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和置信限的構(gòu)造[27]。則有：

其中，6管法和5管法的MPN平均值與置信區(qū)間見表6和表7。

表6 6管法的MPN平均值與95%置信區(qū)間

表7 5管法的MPN平均值與95%置信區(qū)間

根據(jù)計(jì)算的MPN結(jié)果，將MPN值的置信區(qū)間繪制出區(qū)間圖。從圖3和圖4誤差區(qū)間上看，6管法比5管法有更高的準(zhǔn)確度。

圖3 6管法MPN平均值區(qū)間圖

圖4 5管法MPN平均值區(qū)間圖

5.3 MPN的數(shù)值差異

判斷MPN值之間差異的顯著性，可以使用2個(gè)MPN值的合并標(biāo)準(zhǔn)差和t分布標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)表來確定[28]。可得公式為：

計(jì)算6管法與5管法的SDlgMPN值與t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，結(jié)果見表8。

表8 6管法與5管法的SD lg MPN值與t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量

自由度為f=5+6-2=9，查閱置信度a=95%的水平下的t檢驗(yàn)分布表，結(jié)果表明無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即6管法與5管法的MPN結(jié)果未表現(xiàn)出顯著差異?？赡茉蚴鞘軐?shí)驗(yàn)樣本數(shù)量、抽樣量以及其他引起統(tǒng)計(jì)信噪比增大的因素的影響，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以提高實(shí)驗(yàn)精確度。