張房宇

（廣州市從化質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測所 廣東廣州 510925）

1 前言

液相色譜法具有應(yīng)用范圍廣、樣品前處理簡單、高效高速等優(yōu)點。十多年來，相關(guān)學(xué)者對液相色譜法同時檢測食品中2種及以上添加劑的研究有很多，其中，紫外光度檢測器是液相色譜中應(yīng)用最廣泛的檢測器。

同時測定食品中山梨酸、苯甲酸、糖精鈉、安賽蜜、脫氫乙酸的高效液相色譜法[1-15]發(fā)展迅速，被廣泛采用。但是在實際檢測中，由于被測樣品中成份復(fù)雜，大多只經(jīng)簡單預(yù)處理，微孔膜過濾后直接注入液相色譜儀，樣品的基質(zhì)及pH值等因素影響待測物在色譜柱里的吸附洗脫過程，經(jīng)色譜柱分離后得到的色譜峰往往容易發(fā)生漂移，造成根據(jù)色譜峰的保留時間進行定性判定的困難。

圖1 一個混合標(biāo)準樣品與三個待測樣品在230 nm波長下的液相色譜重疊圖

而國外通常采用SPE固相萃取柱對樣品進行前處理，采用固相填料對樣品組分的選擇性吸附、選擇性洗脫的方式，實現(xiàn)對待測物的富集、分離、純化，降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測靈敏度和準確度。但是由于SPE固相萃取柱的采購成本較高，我國并未普遍使用此方法。

目前該液相色譜國標(biāo)檢測方法[18-20]仍舊是依據(jù)保留時間進行定性的，除了改用氣相色譜法、改變流動相[18]或是液質(zhì)聯(lián)用[2，13]的其它定性分析驗證方法外，紫外光譜定性分析在實際檢測應(yīng)用過程中的深入研究未見報道。本文不作檢測方法的討論，只在選定的色譜條件下，利用紫外二極管陣列檢測器對經(jīng)過色譜柱分離出來的標(biāo)準物質(zhì)山梨酸、苯甲酸、糖精鈉、安賽蜜、脫氫乙酸的色譜峰進行光譜掃描，依據(jù)分子吸收光譜原理對其相應(yīng)的紫外光譜圖進行解讀，進一步探討相應(yīng)的標(biāo)準物質(zhì)和待測物的紫外光譜圖在液相色譜法中定性的應(yīng)用，以期對依據(jù)保留時間進行定性的方法作為相互驗證的補充。

2 實驗

2.1 試劑

安賽蜜（純度≥99.0%）；苯甲酸（純度≥99.5%）；山梨酸（純度≥99%）；糖精鈉（純度≥99.0%）；脫氫乙酸（純度≥98.0%）；乙酸銨（天津光復(fù)，分析純）；無水甲醇（色譜純；超純水，自制）；0.45μm微孔過濾膜（津騰）；亞鐵氰化鉀（國藥集團，分析純）；乙酸鋅（天津光復(fù)，分析純）；碳酸氫鈉（天津福晨，優(yōu)級純）。

2.2 主要儀器

主要儀器有高效液相色譜儀組合型（SHIMAD ZN）：含二元LC-10AT VP泵、CTO-10AS VP柱溫箱（帶7725（i）型手動進樣器）、SPD-M20A二極管陳列檢測器、CBM-20A系統(tǒng)控制器；AY-120萬分之一電子分析天平（SHIMADZN）。

2.3 溶液的制備

樣品處理：精確稱取2 g樣品置于50 mL離心管中，各加入2 mL亞鐵氰化鉀（92 g/L）和乙酸鋅（92 g/L），混勻，離心5 min后用稀氨水（1+99）調(diào)pH值近中性，定容于50 mL容量瓶，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，待測。

試劑處理：將配制好的流動相0.02 mol/L乙酸銨緩沖液經(jīng)0.45μm水系微孔濾膜過濾后，脫氣后使用；甲醇經(jīng)0.45μm有機微孔濾膜過濾后，脫氣后使用。

安賽蜜、山梨酸、苯甲酸、糖精鈉、脫氫乙酸標(biāo)準儲備溶液配制（10 mmol/L）：分別精確稱取安賽蜜（0.2012 g）、山梨酸（0.1121 g）、苯甲酸（0.1221 g）、糖精鈉（0.2052 g）、脫氫乙酸（0.1682 g），其中山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸分別加5mL碳酸氫鈉（20 g/L）加熱熔解，加純水定容至100mL；按需用純水稀釋成（0.1～1.0）mmol/L不同濃度水平的系列混合標(biāo)準溶液。

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2.4 色譜分析條件

色譜柱：Shim-pack Vp-ODS C18（4.6 mm×150 mm）；流動相：甲醇-0.02 mol/L乙酸銨緩沖液（體積比為8∶92）；流速：1 mL/min；柱溫：35℃；進樣量5 μL；二極管陣列190～800 nm全掃描。

3 相同液相色譜法條件下的標(biāo)準物質(zhì)紫外光譜圖解析

3.1 安賽蜜標(biāo)準物質(zhì)的紫外光譜圖解析

安賽蜜在波長210 nm～250 nm之間有強吸收帶（見圖2），在最大吸收所對應(yīng)的波長λmax=226 nm處表明其含有2個雙鍵的共軛單位，主要是由位于4-C=O酮鍵與位于5-C=C-雙鍵形成含有雜原子的共軛體系，形成新的成鍵軌道與反鍵軌道，使與π→π*與n→π*的躍遷能級的能差減小，吸收向長波方向位移。

圖2 安賽蜜標(biāo)準物質(zhì)的紫外可見光譜圖

安賽蜜的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

3.2 苯甲酸標(biāo)準物質(zhì)的紫外光譜圖解析

苯甲酸在波長210 nm～240 nm之間有一強吸收帶，在波長250 nm～280 nm之間有一較弱吸收帶，分別稱為E2吸收帶[16]和B吸收帶[16]，相應(yīng)最大吸收所對應(yīng)的波長λmax=223 nm、λmax=268 nm；苯甲酸的E1、E2吸收帶是由苯環(huán)結(jié)構(gòu)中3個乙烯的環(huán)狀共軛系統(tǒng)的躍遷所產(chǎn)生——E1吸收帶因為背景吸收，在圖3中不能完全分得出來，大約在198 nm附近，因此它的E1吸收帶不能做定性依據(jù)。苯甲酸是苯環(huán)上被助色團-COO-取代，由于n→π*共軛，E2吸收帶和K吸收帶合并，吸收峰向長波移動。同時苯環(huán)上有取代基時，顯示精細結(jié)構(gòu)的B吸收帶也簡單化了——這也可能與極性的流動相有關(guān)。

圖3 苯甲酸標(biāo)準溶液的紫外可見光譜圖

苯甲酸分子結(jié)構(gòu)式為：

3.3 山梨酸標(biāo)準物質(zhì)的紫外光譜圖解析

山梨酸在最大吸收所對應(yīng)的波長λmax=253 nm處有一強吸收帶（見圖4），這一強吸收帶表明有3個共軛單位，是由山梨酸2個雙鍵的π→π*共軛和1個羰基鍵-COO-的n→π*共軛產(chǎn)生，此共軛體系為典型K吸收帶[16]。除此之外，通過放大圖4觀察到山梨酸在λmax=322 nm處有一微弱吸收帶，這一微弱吸收帶是由羰基基團-COO-同時發(fā)生n→π*躍遷產(chǎn)生，也被稱為R（基團）吸收帶[16]。

圖4 山梨酸標(biāo)準溶液的紫外可見光譜圖

山梨酸鉀分子結(jié)構(gòu)式為：

3.4 糖精鈉標(biāo)準物質(zhì)的紫外光譜圖解析

糖精鈉在最大吸收所對應(yīng)的波長λmax=206nm處有一強吸收帶（見圖5），為糖精鈉的鄰甲?；?、磺酰亞胺基n→π*躍遷和與苯環(huán)共軛（π→π*共軛），K吸收帶[16]和E2吸收帶重合（峰谷變淺），并略向長波移動（苯的E2吸收帶在λmax=204 nm）。同苯甲酸，帶苯環(huán)的糖精鈉在λmax=265 nm處也有B吸收帶。

圖5 糖精鈉標(biāo)準溶液的紫外可見光譜圖

糖精鈉分子結(jié)構(gòu)式為：

3.5 脫氫乙酸標(biāo)準物質(zhì)的紫外光譜圖解析

脫氫乙酸在最大吸收所對應(yīng)的波長λmax=230 nm處有一強吸收帶（見圖6），為脫氫乙酸吡喃環(huán)中雙鍵π→π*躍遷與酮基團n→π*雜原子共軛產(chǎn)生，是K吸收帶。在λmax=292 nm處有一較強吸收帶，為脫氫乙酸吡喃環(huán)中2，4-酮基與3-羰基中含有σ鍵和π鍵，發(fā)生π→π*躍遷產(chǎn)生，也是K吸收帶。

圖6 脫氫乙酸標(biāo)準溶液的紫外可見光譜圖

脫氫乙酸分子結(jié)構(gòu)式為：

4 液相光譜圖定性分析討論與例證

觀察以上紫外可見光譜圖（圖2～6），處于同種極性的流動相中5種標(biāo)準物質(zhì)主要是在200 nm～380 nm的近紫外區(qū)存在強吸收帶，通過不同的吸收帶可以推斷出化合物的官能團（生色團[8]），為了區(qū)分色譜峰的純度，本文完整保存了可見光譜圖。一般來在相同的方法條件下，首先通過液相光譜圖比較待測物與標(biāo)準物質(zhì)所有的最大吸收所對應(yīng)的波長λmax，如果λmax不同，則可以判定二者不是同一種物質(zhì)（如圖8、圖9），不論是這二者的色譜峰保留時間相同或是接近。反之，二者所有的最大吸收所對應(yīng)的波長λmax相同，則可認為待測物與標(biāo)準品具有相同的官能團或生色基團，但不能認為它們是同一物質(zhì)。

圖7 蜂蜜話梅樣品的液相色譜圖（誤檢出“苯甲酸”和“山梨酸”，檢出糖精鈉）

圖8 蜂蜜話梅樣品中誤檢出“苯甲酸”的紫外可見光譜圖

圖9 蜂蜜話梅樣品中誤檢出“山梨酸”的紫外可見光譜圖

4.1 液相色譜中摩爾吸收系數(shù)（εmax）數(shù)值比較法

在紫外可見分光光度法中，如果待測物與標(biāo)準物質(zhì)的最大吸收所對應(yīng)的波長λmax相同，還得比較它們的摩爾吸收系數(shù)εmax，只有待測物與標(biāo)準物質(zhì)的最大吸收所對應(yīng)的波長λmax和εmax都相同，才可以認為兩者是相同物質(zhì)[16]。根據(jù)朗伯-比爾公式A=εbc，c的單位為mol/L，b的單位為cm時；在本文所用的島津液相色譜儀中SPD-M20A二極管陳列檢測器流通池的光程為10 cm，mAU是液相色譜中的吸收度單位，將各自標(biāo)準物質(zhì)對應(yīng)最大吸收所對應(yīng)的波長λmax處的吸收值代入上式，可以反推算出液相色譜版的摩爾吸收系數(shù)εmax＝A/bc。通過相同色譜條件下的在（0.1～1.0）mmol/L濃度范圍同種標(biāo)準物質(zhì)的光譜圖數(shù)據(jù)，計算出的上述5種標(biāo)準物質(zhì)分別各自特征波長λmax處的εmax（見表1）。

表1 五種標(biāo)準物質(zhì)色譜峰的λmax、εmax與吸收比（A1/A 2）

在液相色譜法中，上述同種標(biāo)準樣品在一定濃度范圍內(nèi)對應(yīng)λmax處的εmax數(shù)值都非常接近，εmax數(shù)值隨著標(biāo)準樣品濃度的降低緩慢的減小，εmax數(shù)值隨著標(biāo)準樣品濃度的升高緩慢的增加。只有在2個濃度差別大的同種標(biāo)準樣品的εmax數(shù)值才會出現(xiàn)大的偏離，在相同的檢測條件下要求標(biāo)物的濃度要盡可能和未知物的濃度接近。但在檢測中由于未知物的濃度未知，通過液相外標(biāo)法計算出其濃度后再折算成εmax數(shù)值與標(biāo)物εmax數(shù)值進行比較的方法，仍有待與其它方法的驗證，該方法并不太實用。

從表1可以看出，當(dāng)εmax數(shù)值＞1×104數(shù)量級時，吸收峰（λmax）處于200 nm～300 nm時，就可以推斷此化合物存在共軛雙鍵；苯甲酸和糖精鈉B吸收帶的εmax數(shù)值較弱，山梨酸R吸收帶的εmax數(shù)值最弱。

4.2 雙波長吸收比法

對比任何在紫外－可見光區(qū)有吸收的純物質(zhì)在2個選定波長下的吸收比為一常數(shù)，且與濃度無關(guān)[17]。對此，選取具有特征雙峰的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸進行了雙波長（λmax）處吸收比（A1/A2）的驗證，在相同檢測條件下，經(jīng)計算在（0.1～1.0）mmol/L濃度范圍內(nèi)上述4種標(biāo)準物質(zhì)的吸收比（A1/A2）結(jié)果見表1。

苯甲酸與糖精鈉同為苯環(huán)結(jié)構(gòu)，E2吸收帶與B吸收帶的吸收比（A1/A2）非常接近，只不過是雙峰特征波長λ1、λ2各不相同；由于山梨酸K吸收帶強度非常強和R吸收帶強度相當(dāng)弱，以致于二者比值相當(dāng)大；而脫氫乙酸在λ1＝230 nm與λ2＝292 nm處的吸收比大約為2倍。雜質(zhì)的存在都會使它們之間的比值發(fā)生偏離，吸收比的可靠性依賴于波長的選擇及吸收值的區(qū)別，波長應(yīng)盡量選擇在具有最大吸收所對應(yīng)的波長λmax處。因此，如果待測物與標(biāo)準物質(zhì)的最大吸收波長λ1和λ2都相同，及二者的雙波長吸收比（A1/A2）接近，則可認為待測物與標(biāo)準物質(zhì)是同一物質(zhì)。例如，圖11待測物檢出的糖精鈉λ1、λ2及吸收比（A1/A2）：13.4，與表1中標(biāo)準物質(zhì)的糖精鈉λ1、λ2相同及吸收比（A1/A2）：12～14相當(dāng)接近。

4.3 色譜峰紫外歸一化光譜圖對比法

一般選保留時間處的色譜峰光譜圖進行對比，如果待測物色譜峰的紫外光譜圖與標(biāo)準物質(zhì)色譜峰的紫外光譜圖是重合的——只是色譜峰的前沿、峰谷、峰頂、峰尾各點組成的光譜圖只在振幅響應(yīng)上有大小的差別，則可以判定，待測物與標(biāo)準物是同一物質(zhì)[17]（如圖10檢出糖精鈉）；反之，如果二者的紫外光譜圖是完全不一致，則二者就不是同一物質(zhì)。如果待測物色譜峰光譜圖的峰頂波長與標(biāo)準物質(zhì)色譜峰光譜圖的峰頂波長（λmax）相同，但是待測物色譜峰光譜圖其它位置出現(xiàn)不一致或是出現(xiàn)其它雜峰，這時就說明樣品有雜質(zhì)未能有效分離，色譜峰不純，這時就得改進樣品前處理，或是改變流動相配比，或是采用柱效更好的色譜柱，或是嚴格采用國家安全標(biāo)準里的仲裁方法進行驗證。由于液相色譜儀的紫外光度檢測器波長存在示值誤差（最大允許誤差±2 nm[21]），應(yīng)定期對液相進行檢定或校準；加上紫外光度檢測器使用過程中會發(fā)生漂移，因此對于標(biāo)準物質(zhì)和待測物色譜峰光譜圖的峰谷、峰頂也是允許存在±2 nm誤差（如圖10檢出的糖精鈉在B吸收帶λmax=263 nm，偏離2 nm）。

圖10 蜂蜜話梅樣品中檢出糖精鈉的紫外可見光譜圖

5 結(jié)論

在選定的色譜條件下，應(yīng)首先通過二極管陣列檢測器對標(biāo)準物質(zhì)的色譜峰進行掃描，得到該標(biāo)準物質(zhì)的紫外可見光譜圖，建立本機標(biāo)準物質(zhì)的紫外可見標(biāo)準圖譜庫；當(dāng)待測物色譜峰的保留時間不一致時或是出現(xiàn)可疑色譜峰時，采用本機的紫外可見標(biāo)準圖譜庫對可疑待測物的進行定性分析是可行的和必要的；液相色譜法的定量檢測和紫外光譜圖定性鑒別同時進行是高效的，發(fā)現(xiàn)可疑待測物時可以不用再通過改變流動相等其它方法重復(fù)試驗，可以節(jié)省試驗時間，從而達到液相定性分析和定量分析的統(tǒng)一。

在實際檢測應(yīng)用中，通常采用色譜峰紫外歸一化光譜圖對比法就能夠?qū)Υ郎y物的定性分析做到不漏檢、不誤判，也可以輕松地剔除小雜質(zhì)峰，該方法也是最為簡便直觀有效的。此外，帶有定時間掃描的紫外檢測器液相色譜儀也可以借鑒上述方法，根據(jù)色譜峰的保留時間用定時間程序來進行光譜掃描。因此，通過液相色譜法的紫外可見光譜圖進行定性分析和簡單分子結(jié)構(gòu)推斷的方法是可行的，建立本機乃至全國共享標(biāo)準物質(zhì)的紫外可見標(biāo)準圖譜具有重要的參考意義。