陳薈旭，潘姣姣，桂成坤，孫鵬亮，張秋林，魏鑫豪，李蓮瑞

（1.塔里木大學 動物科學學院，新疆 阿拉爾843300；2.塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾843300；3.新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾843300）

0 引言

芽胞桿菌是一類好氧或兼性厭氧[1-2]、能產(chǎn)生內(nèi)生胞子并具有繁殖快速、生命力極強等特性的革蘭陽性菌。該菌廣泛分布于土壤、水、空氣、動物腸道和植物體內(nèi)[3-5]。如今乳制品受到廣大消費者的青睞，國家對其質(zhì)量安全要求更高，牛乳在嚴格的加工流程中經(jīng)殺菌處理后，有些耐熱性芽胞仍可能殘留于乳中或在其它生產(chǎn)環(huán)節(jié)被芽胞桿菌污染，受到污染的乳制品被消費者食用后嚴重的可能危及生命。根據(jù)各國的研究調(diào)查表明，污染乳制品的細菌大多都是芽胞桿菌。生慶海[6]等研究了滅菌乳中芽胞桿菌產(chǎn)酶與乳品質(zhì)的關系，發(fā)現(xiàn)了芽胞桿菌的酶能水解乳蛋白，產(chǎn)生蛋白變性，使酸度提高、產(chǎn)生沉淀等。陳霞[7]等人研究了耐熱芽胞桿菌的最適生長溫度，并對芽胞桿菌經(jīng)過不同溫度熱處理后的活性進行了研究。本實驗擬從品質(zhì)異常的全脂滅菌乳中分離芽胞桿菌，并對其進行一些研究和分析，希望找到污染此類乳制品的芽胞桿菌。

1 試驗材料

1.1 樣品來源

異常全脂滅菌乳（異?，F(xiàn)象為：味道微苦，有蛋白凝集、沉淀，微有漲袋），由南疆某乳品企業(yè)提供，取回后4℃保存?zhèn)溆?，用于分離異常全脂滅菌乳中的芽胞桿菌。

1.2 試驗藥品

氯化鈉，氫氧化鈉，無水乙醇，結(jié)晶紫，草酸銨，碘，碘化鉀，丙酮，番紅，孔雀石綠，蛋白胨，酵母粉，瓊脂，瓊脂糖，核酸染料，溶菌酶，甘油，錳鹽營養(yǎng)瓊脂，普通營養(yǎng)瓊脂，嗜冷菌計數(shù)瓊脂，DNA maker，氨芐青霉素（Ampicillin Na）。

1.3 試劑和儀器

95%乙醇溶液，結(jié)晶紫溶液，碘液，0.5%的番紅乙醇溶液，1%氫氧化鈉溶液，飽和孔雀綠溶液，無菌水。恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；高壓鍋，日本TOMY KOGYO公司；小型臺式高速離心機，Eppendorf公司；小型高速冷凍離心機，Eppendorf公司；微波爐，格蘭仕微波爐電器有限公司；潔凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司；顯微鏡，日本尼康株式會社；微量移液器，Thermo科技有限公司；水浴鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；加熱制冷循環(huán)器，德國JULABO Laborteckmik G mbh。

2 實驗方法

2.1 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的篩選、分離、純化

取樣：袋裝全脂滅菌乳（利樂包），潔凈工作臺內(nèi)無菌操作將乳樣分裝到無菌250 mL錐形瓶中100 mL。

接種：將取出乳樣80℃水浴20 min，水浴后用無菌蒸餾水倍比稀釋5個梯度，涂布法分別接種于錳鹽營養(yǎng)瓊脂55℃培養(yǎng)和普通營養(yǎng)瓊脂37℃培養(yǎng)24～48 h，嗜冷菌計數(shù)瓊脂5℃培養(yǎng)5～7 d，倒置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

純培養(yǎng)：觀察培養(yǎng)的細菌形態(tài)，選取單菌落于不同培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。

對純培養(yǎng)的細菌進行制片，革蘭染色和芽胞染色和鏡檢，篩選：選取單菌落中有芽胞的菌體，接種于裝有8 mL液體培養(yǎng)基的細菌瓶中搖菌擴增，用于DNA提取。

2.2 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌DNA的提取

取擴菌后的細菌1 mL于1.5 mL的無菌離心管內(nèi)，12000 rpm離心1 min，棄上清，重復一次，收集適量細菌。細菌DNA提取方法按照北京全式金生物技術有限公司DNA提取試劑盒（M 10208）說明書進行操作。提取的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌16S rDNA克隆的質(zhì)粒鑒定

2.3.1 對PCR產(chǎn)物切膠回收

按照北京全式金生物技術有限公司膠回收試劑盒（L41118）說明書進行操作，回收的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 目的基因與連接T載體

回收的PCR產(chǎn)物連接到p MD-19T載體上，于加熱制冷循環(huán)器16℃連接過夜。連接反應體系反應液組分16SrDNA片段0.5μL、p MD-19T Vector 3.5μL、Solution I 6μL。

2.3.3 轉(zhuǎn)化克隆和菌液PCR鑒定

將連接物7μL加入到100μL感受態(tài)細胞DH 5α中，冰浴30 min，42℃熱沖擊90 s，再置于冰中1 min，加入含Amp+（50μg/m L）的LB液體培養(yǎng)基900μL，37℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)1 h，取轉(zhuǎn)化菌100μL使用涂菌珠涂布于含有Amp+（50μg/mL）的瓊脂平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)出細菌后，挑取單菌落，于含Amp+（50μg/m L）的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用菌液做PCR（細菌通用引物序列如下：27F：5'-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R-5'-CGGTACCTTGTTACGACTT-3'進行PCR擴增。PCR擴增體系為：DNA模擬1μL；上游引物和下游引物各0.5μL；EasyTaq SuperMix12.5μL，加入dd H2O補至25μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s；72℃延伸90 s；35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物徑1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察是否有目的條帶。擴增芽胞桿菌16s rDNA的序列），1%瓊脂糖電泳后，觀察條帶大小。

2.3.4 提取質(zhì)粒與質(zhì)粒電泳鑒定

提取質(zhì)粒按照天根生化科技有限公司的高純度質(zhì)粒小提試劑盒說明書進行操作。取20μL質(zhì)粒與p MD-19T Vector自連，經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，察看電泳條帶大小。

2.3.5 測序

對于菌液PCR結(jié)果為陽性的克隆細菌，提取其質(zhì)粒，送測序。

2.3.6 序列分析

將測序序列在NCBI上進行核苷酸序列比對，判定該芽胞桿菌的種屬。

3 結(jié)果與分析

3.1 品質(zhì)異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的篩選、分離、純化結(jié)果

將異常酸牛乳樣于80℃水浴20 min，水浴后分離得到單菌落，經(jīng)革蘭染色，初步鑒定為芽胞桿菌后，將細菌純化后培養(yǎng)結(jié)果見圖1。菌落形態(tài)：菌落小，淡黃色，圓形，隆突，有光澤，半透明。

圖1 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌

3.2 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的染色結(jié)果

異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌D革蘭染色結(jié)果見圖2。

圖2 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌革蘭染色1000×

異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌D經(jīng)過芽胞染色以后，結(jié)果見圖3。

圖3 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌芽胞染色1000×

3.3 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的基因組提取結(jié)果

將液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的芽胞桿菌D，使用全式金DNA提取試劑盒（M 10208）提取DNA后，經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，結(jié)果如圖4。由圖可以看出，芽胞桿菌D的基因組提取成功。

圖4 細菌基因組的電泳結(jié)果

3.4 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的的16S rDNA擴增結(jié)果

提取芽胞桿菌D基因組DNA，用細菌通用引物16SrDNA對其擴增，PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖5。

由圖可以看出，使用細菌16S rDNA通用引物序列擴增出了芽胞桿菌D的16S rDNA基因大小約為1500 bp，與預期大小相符。

3.5 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的16S rDNA克隆質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

將16S rDNA片段和p MD-19T Vector連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5a，涂布于含有Amp+（50μg/mL）的瓊脂平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)出細菌后，挑取單菌落，于含Amp+（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取大腸桿菌的質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖電泳，PMD-19T Vector自連為對照，結(jié)果如圖6。

圖6 16SrDNA克隆質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

由圖可看出，克隆出的16S rDNA基因大小為1500 bp左右，與篩選出的芽胞桿菌的16S rDNA基因大小相同，該陽性克隆可送測序。

3.6 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的16S rDNA的測序結(jié)果

細菌D的序列如下：

3.7 序列分析結(jié)果

將測序序列在NCBI上進行核苷酸序列比對，判定該芽胞桿菌的種屬，比對結(jié)果見表1。

表1 異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌序列比對結(jié)果

3.8 短小芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構建及分類

將其結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進行核酸比對，建立進化樹后分析表明，該菌株與登錄號為KR 780437、KU 662344、KU 662334、MT 052639、KU 681229、JN 578480、MN 704393的短小芽胞桿菌處于同一分支，且根據(jù)同源性分析，該菌株與登錄號為KR 780437、KU 681229、MN 704393、JN 578480的短小芽胞桿菌的同源性為100%，根據(jù)以上結(jié)果，可以確定該菌株為短小芽胞桿菌。進化樹分析結(jié)果和同源性比較如下，見圖7～8。

圖7 短小芽胞桿菌進化樹

圖8 同源性分析

4 討 論

芽胞桿菌在惡劣環(huán)境條件下，脫水形成休眠體芽胞。芽胞的結(jié)構復雜，最里面為核芯，含原生質(zhì)體，被芽孢膜所包裹。由于芽孢的多層結(jié)構，其對熱、干燥和其他理化因素具有較強的抗性，滅殺的要求更苛刻。因此乳制品生產(chǎn)過程中,可能存在芽胞桿菌經(jīng)熱處理后沒有被殺死,隨生產(chǎn)流程進入管道，管道中乳制品營養(yǎng)較豐富,這些細菌形成生物膜包裹自身[8]，隨著生產(chǎn)線進入下一生產(chǎn)階段直至生物膜成熟后釋放包裹的芽胞桿菌污染整個乳制產(chǎn)品[9]。韓永霞[10]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過超高溫瞬時滅菌的制品中依然存在地衣芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌等嗜熱芽胞桿菌的污染，王林林[11]以5種不同品牌的瞬時高溫滅菌牛奶為研究樣本，從中分離鑒定出短小芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌等。短小芽胞桿菌能代謝產(chǎn)生堿性蛋白酶、脂肪酶和膠原蛋白酶等，在牛奶營養(yǎng)瓊脂上形成透明的水解圈，是一種能引起食源性疾病的腐敗菌[12]，劉潤身[13]在乳品污染水中分離出蛋白降解菌，鑒定為短小芽胞桿菌，該菌對乳品的危害較大，卻未見有該菌引起食物中毒報道，可能是該菌污染食品的幾率小。本實驗在滅菌乳中檢測出短小芽胞桿菌，卻未見原料乳中存在，說明該菌是在UHT殺菌后污染進入乳品中的，可能存在該菌的環(huán)節(jié)是冷卻和灌裝環(huán)節(jié)?？挡┭郲14]調(diào)查了乳品生產(chǎn)環(huán)境中微生物，短小芽胞桿菌存在于乳品加工車間的灌裝間和外包裝車間。控制該芽胞桿菌的污染乳制品，應提高乳品加工車間及生產(chǎn)設備的清洗消毒程度。本實驗從異常全脂滅菌乳中分離鑒定出了短小芽胞桿菌。

5 結(jié) 論

本實驗通過對異常全脂滅菌乳中芽胞桿菌的篩選、分離、培養(yǎng)、純化，經(jīng)16SrDNA鑒定出異常全脂滅菌乳中存在嗜熱菌：短小芽胞桿菌，該乳品受短小桿菌污染。