胡安全　　王正安　　秦力　　李哲　　馮祁軍

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;神經(jīng)元樣細(xì)胞;坐骨神經(jīng)損傷;生物力學(xué);神經(jīng)修復(fù)

[中圖分類號(hào)] R329.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）15-0027-05

Repairing effects and biomechanical evaluation of mesenchymal stem cells induced into neuron-like cells on sciatic nerve injury in rats

HU Anquan? ?WANG Zheng′an? ?QIN Li? ?LI Zhe? ?FENG Qijun

Department of Orthopedics， the First Hospital of Jiaxing in Zhejiang Province， Jiaxing? ?314000， China

[Abstract] Objective To research the repairing effects and biomechanical evaluation of mesenchymal stem cells （BM-MSCs） induced into neuron-like cells on sciatic nerve injury in rats. Methods The purified rat BM-MSCs were obtained in vitro， and the BM-MSCs were differentiated into neuron-like cells by β-mercaptoethanol inducer. A total of 80 SD rats were divided into the sham operation group， the model group， the normal cell group and the directional induction group. Excepted the sham operation group， the other three groups were used to establish rat sciatic nerve crush injury models. In rats of the normal cell group and the directional induction group， BM-MSCs or neuron-like directional differentiation BM-MSCs were injected into the sciatic nerve injury respectively. The sham operation group and the model group were injected with the same dosage of normal saline. The sciatic nerve function index （SFI） was measured， the motor function of rats was evaluated by Bsso-Beattie-Bresnahan（BBB） scoring method， and its biomechanics was evaluated by electrophysiological examination of sciatic nerve and unidirectional stretching test of sciatic nerve. The expression levels of brain-derived neurotrophic factor （BDNF）， myelin basic protein （MBP） and growth-associated protein 43 （GAP-43） in neurogenic encephalopathy were detected by Western blot method. Results Compared with the sham operation group， the SFI index and BBB score of sciatic nerve in rats of the model group were all decreased， the expression levels of BDNF， MBP and GAP-43 protein were decreased， and the amplitude value， motor conduction velocity， maximum stress， maximum strain， elastic limit stress and elastic limit strain were also decreased significantly（all P<0.05）. However， compared with the model group， the above-mentioned indexes in the normal cell group and the directional induction group were increased， especially in the directional induction group （all P<0.05）. Conclusion BM-MSCs induced into neuron-like cells have obvious repairing effects on sciatic nerve injury in rats.

[Key words] Bone marrow mesenchymal stem cells; Neuron-like cells; Sciatic nerve injury; Biomechanics; Nerve repairing

外傷性周圍神經(jīng)損傷是一種重要的臨床和公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]，尤其以臀部坐骨神經(jīng)損傷最難處理且預(yù)后最差[2]。這與周圍神經(jīng)系統(tǒng)的再生和修復(fù)能力有限有關(guān)，易導(dǎo)致與之相關(guān)的器官結(jié)構(gòu)和功能的永久性損傷[3]。近年來(lái)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow stromal stem cells，BM-MSCs）已被用作Schwann細(xì)胞的替代品，在治療周圍神經(jīng)損傷方面顯示出巨大的潛力[4]。劉峰等[5]研究表明，在特定誘導(dǎo)劑的作用下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外亦可定向向神經(jīng)細(xì)胞分化。因此，本研究將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞，繼而回植入大鼠體內(nèi)，研究其對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的治療作用及機(jī)制，以期為坐骨神經(jīng)損傷的治療提供新的治療方法及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑

MODEL55100電子萬(wàn)能自動(dòng)控制試驗(yàn)機(jī)購(gòu)自中國(guó)長(zhǎng)春試驗(yàn)機(jī)研究所;MedlecSynergy型肌電圖儀購(gòu)自英國(guó)Oxford儀器公司;小動(dòng)物手術(shù)顯微鏡和非吸收尼龍縫線（帶針）購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司;免疫印跡一抗腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、髓磷脂堿性蛋白（Myelin basic protein，MBP）與和生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)蛋白43（Growth associated protein-43，GAP-43）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2大鼠BM-MSCs提取、鑒定及向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化

取4只健康成年SD大鼠雙側(cè)后腿，解剖股骨和脛骨，用無(wú)菌的DMEM/F12完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨骼變白。經(jīng)常規(guī)細(xì)胞貼壁篩選法及多次傳代在體外進(jìn)行純化后獲得大鼠BM-MSCs，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志分子CD29、CD44、CD90以及造血細(xì)胞標(biāo)志物CD45的表達(dá)情況。將獲得的BM-MSCs接種于培養(yǎng)板中，待細(xì)胞鋪滿孔底達(dá)90%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基。用化學(xué)誘導(dǎo)劑β-巰基乙醇誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性細(xì)胞的陽(yáng)性率，將獲得的神經(jīng)元樣細(xì)胞用于后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.3動(dòng)物分組與模型建立

84只（包含4只用于提取BM-MSCs，余80只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組）成年健康SPF級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（遼）2018-0004）]，雌雄不限，實(shí)驗(yàn)過(guò)程得到我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵守國(guó)家研究委員會(huì)護(hù)理和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指南（1996年修改）。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、普通細(xì)胞組與定向誘導(dǎo)組。用鉗夾坐骨神經(jīng)的方法構(gòu)建大鼠單側(cè)坐骨神經(jīng)損傷模型[6]。3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，剃毛備皮，常規(guī)消毒固定。無(wú)菌條件下取左股后上部縱形切口，自股二頭肌與半腱肌、半膜肌間鈍性分離，充分暴露坐骨神經(jīng)，在坐骨結(jié)節(jié)下方0.5 cm處，鉗夾10 s，反復(fù)3次，造成3 mm的損傷區(qū)，手術(shù)過(guò)程中，顯微鏡觀察到其外膜連續(xù)而神經(jīng)軸突中斷。依次縫合肌肉皮膚，消毒后常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)后次日，分別將未做任何誘導(dǎo)分化處理的BM-MSCs（約1×106個(gè)細(xì)胞）和誘導(dǎo)分化成功的神經(jīng)元樣細(xì)胞（約1×106個(gè)細(xì)胞）植入普通細(xì)胞組和定向誘導(dǎo)組大鼠坐骨神經(jīng)損傷處。另外假手術(shù)組和模型組大鼠分別給予等量（1 mL）生理鹽水。

1.4坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（Sciatic function index，SFI）評(píng)分[6]

分別于術(shù)后第2、4、8、12周進(jìn)行坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測(cè)定。自制長(zhǎng)90 cm、寬 15 cm、高 20 cm的大鼠足行走箱。箱底放置寬15 cm的連續(xù)記錄紙。大鼠雙后足蘸炭素墨水后放入行走箱入口，大鼠在向遠(yuǎn)端爬行過(guò)程中每側(cè)留4～5個(gè)足印，選實(shí)驗(yàn)側(cè)肢（E）和健側(cè)肢（N）足印，測(cè)量以下變量：足印長(zhǎng)度（Paw length，PL）=足跟到足尖的距離;足趾寬度（Toe spread，TS）=第一趾到第五趾連線的距離;中間足趾距離（IT）=第二趾到第四趾連線的距離。將上述三個(gè)變量代入Bain公式計(jì)算SFI，以SFI=0為正常值，-100為神經(jīng)完全斷離指標(biāo)。SFI=-38.3×（EPL-NPL）/NPL+109.5×（ETS-NTS）/NTS+13.3×（EIT-NIT）/NIT-8.8。

1.5大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)

每次觀察4 min內(nèi)各組大鼠的運(yùn)動(dòng)情況，兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的觀察者獨(dú)立地使用Bsso-Beattie-Bresnahan（BBB）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)情況進(jìn)行打分，分值范圍0分（無(wú)自發(fā)運(yùn)動(dòng)）～21分（運(yùn)動(dòng)正常）。在手術(shù)前記錄1次BBB評(píng)分，以建立基線對(duì)照。手術(shù)后每間隔7 d記錄1次各組大鼠BBB評(píng)分，連續(xù)記錄12周。

1.6電生理檢測(cè)

術(shù)后12周，大鼠用10%水合氯醛麻醉，俯臥在自制手術(shù)臺(tái)上，暴露左、右側(cè)坐骨神經(jīng)干。

安裝兩個(gè)接地電極-單極直針電極（26G）和螺旋電極。直針電極插入鄰近肌肉組織內(nèi)，螺旋電極定位于神經(jīng)周圍。高頻濾波器設(shè)置為5 kHz，低頻濾波器設(shè)置為2 Hz。對(duì)每一個(gè)所獲得的電位（復(fù)合神經(jīng)動(dòng)作電位和復(fù)合肌肉動(dòng)作電位），刺激為方形電脈沖（持續(xù)時(shí)間0.04 ms，電流20 mA，6個(gè)連續(xù)刺激），誘發(fā)出動(dòng)作電位波幅及潛伏期。由兩個(gè)刺激點(diǎn)之間的距離除以不同的傳導(dǎo)時(shí)間計(jì)算神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

1.7單向拉伸實(shí)驗(yàn)[8]

10%水合氯醛麻醉大鼠后，在神經(jīng)吻合處的中點(diǎn)取各組大鼠的兩側(cè)坐骨神經(jīng)（長(zhǎng)約20 mm），大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)為正常對(duì)照組。取出坐骨神經(jīng)后，在麻醉狀態(tài)下斷頭處死大鼠。室溫下將每個(gè)坐骨神經(jīng)試樣安裝到試驗(yàn)機(jī)拉伸夾頭中，以1.5 mm/min的增加速度對(duì)坐骨神經(jīng)試樣施加拉伸載荷。

1.8蛋白免疫印跡法（western blot）

將收集的坐骨神經(jīng)組織在液氮中研磨成粉后，用RIPA細(xì)胞裂解液提取各組大鼠坐骨神經(jīng)總蛋白，取各蛋白樣品于10%聚丙烯酰胺凝膠中設(shè)置80 V（1.5 h）/100 V（0.5 h）電壓電泳。將蛋白條帶轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上后用5%的牛血清白蛋白封閉2 h。分別加入BDNF、MBP與和GAP-43蛋白抗體孵育過(guò)夜。再用山羊抗兔IgG二抗孵育2 h后顯影，最后以β-actin作為內(nèi)標(biāo)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），再采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 BM-MSCs提取、鑒定及向神經(jīng)元樣定向誘導(dǎo)分化

置于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，大鼠BM-MSCs呈典型的長(zhǎng)梭形，排列整齊，旋渦樣生長(zhǎng)。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定，培養(yǎng)P3代的BM-MSCs高表達(dá)CD29（98.35±0.14）%、CD44（98.53±0.08）%、CD90（97.31±0.15）%，幾乎不表達(dá)CD45（1.05±0.03）%。然后用化學(xué)誘導(dǎo)劑β-巰基乙醇誘導(dǎo)大鼠BM-MSCs向神經(jīng)元樣定向分化，誘導(dǎo)7 d后，細(xì)胞逐漸向神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)分化，出現(xiàn)軸突樣類似物，細(xì)胞體收縮，遮光性增強(qiáng)。神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性細(xì)胞的陽(yáng)性率為（39.75±3.34）%，故可用于后續(xù)試驗(yàn)。見(jiàn)封三圖4。

2.2定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞的BM-MSCs對(duì)SFI的影響

術(shù)后2、4、8、12周時(shí)，模型組大鼠SFI顯著低于假手術(shù)組，而定向誘導(dǎo)組大鼠SFI一直高于模型組、普通細(xì)胞組（均P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞的BM-MSCs對(duì)BBB評(píng)分的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠術(shù)后12周各時(shí)間點(diǎn)的BBB評(píng)分均顯著降低;但是與模型組相比，普通細(xì)胞組和定向誘導(dǎo)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分均顯著升高，尤其是定向誘導(dǎo)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分高于普通細(xì)胞組（均P<0.05）。

2.4定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞的BM-MSCs對(duì)電生理測(cè)定結(jié)果的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠波幅值和運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度值均顯著降低;但是與模型組相比，普通細(xì)胞組和定向誘導(dǎo)組大鼠波幅值和運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度值均顯著升高，尤其是定向誘導(dǎo)組大鼠波幅值和運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度值高于普通細(xì)胞組（均P<0.05）。

2.5定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞的BM-MSCs對(duì)拉伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠坐骨神經(jīng)最大應(yīng)力、最大應(yīng)變、彈性限度應(yīng)力、彈性限度應(yīng)變均顯著降低;但是與模型組相比，普通細(xì)胞組和定向誘導(dǎo)組大鼠坐骨神經(jīng)最大應(yīng)力、最大應(yīng)變、彈性限度應(yīng)力、彈性限度應(yīng)變均顯著升高，尤其是定向誘導(dǎo)組大鼠坐骨神經(jīng)最大應(yīng)力、最大應(yīng)變、彈性限度應(yīng)力、彈性限度應(yīng)變高于普通細(xì)胞組（均P<0.05）。

2.6定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞的BM-MSCs對(duì)BDNF、MBP與和GAP-43蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠坐骨神經(jīng)BDNF、MBP與和GAP-43蛋白表達(dá)量均顯著降低;但是與模型組相比，普通細(xì)胞組和定向誘導(dǎo)組大鼠坐骨神經(jīng)BDNF、MBP與和GAP-43蛋白表達(dá)量均顯著升高，尤其是定向誘導(dǎo)組大鼠坐骨神經(jīng)BDNF、MBP與和GAP-43蛋白表達(dá)量高于普通細(xì)胞組（均P<0.05）。

3 討論

坐骨神經(jīng)是由L4～5和S1～3神經(jīng)根組成[9]。臨床上坐骨神經(jīng)常由于擠壓、壓迫、拉伸、撕脫和分裂而受損，多見(jiàn)于腰椎間盤(pán)突出癥、梨狀肌綜合征、髖關(guān)節(jié)脫臼或骨盆骨折等[10]。坐骨神經(jīng)損傷是生活中常見(jiàn)的疾病，當(dāng)坐骨神經(jīng)受傷后，患者患肢顯示疼痛相關(guān)的步態(tài)和腫脹，不僅影響到正常行走，也會(huì)導(dǎo)致腿部的肌肉喪失功能。盡管坐骨神經(jīng)修復(fù)技術(shù)不斷改進(jìn)，但單純外科手術(shù)的治療效果仍差強(qiáng)人意。這主要是由于坐骨神經(jīng)組織再生能力差，損傷后局部微環(huán)境不利于軸突生長(zhǎng)，以及損傷部位膠質(zhì)瘢痕的形成等原因[11]。為了使損傷的坐骨神經(jīng)恢復(fù)到損傷前的水平，研究人員做了大量的研究，如同種異體神經(jīng)移植，但是移植后的排除反應(yīng)不可避免[12]。

近年來(lái)，基于BM-MSCs的治療已經(jīng)成為促進(jìn)神經(jīng)再生的一種十分有前途的治療方法。BM-MSCs可以從脂肪、臍帶血，胚胎以及骨髓中獲得[13]。它們具有分化為骨髓基質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、腱細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞的潛能，故而可用于再生細(xì)胞治療[14]。在本研究中利用常規(guī)細(xì)胞貼壁篩選法及多次傳代獲得純化的大鼠BM-MSCs，置于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，大鼠BM-MSCs呈典型的長(zhǎng)梭形，排列整齊，旋渦樣生長(zhǎng)。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定，培養(yǎng)P3代的BM-MSCs高表達(dá)CD29、CD44、CD90，幾乎不表達(dá)CD45。BM-MSCs因具備橫向分化潛能，在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)作用下，少部分BM-MSCs在體內(nèi)可分化為神經(jīng)外胚層樣細(xì)胞，但是仍有大部分BM-MSCs分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞。因此在應(yīng)用BM-MSCs時(shí)，在體外成功將其定向分化的技術(shù)將至關(guān)重要，這在很大程度上會(huì)影響疾病的治療效果。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者將BM-MSCs定向誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法主要包括化學(xué)誘導(dǎo)法（β-巰基乙醇，全反式視黃酸）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)法、Transwell小室共培養(yǎng)等。β-巰基乙醇是研究較早且較為成熟的一種分化誘導(dǎo)劑，通過(guò)提高胞質(zhì)內(nèi)抗氧化成分-谷胱甘肽的水平降低氧自由基的生成量以達(dá)到誘導(dǎo)細(xì)胞分化的目的。關(guān)寧等[22]曾比較β-巰基乙醇和神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)BM-MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的可行性，結(jié)果證實(shí)，β-巰基乙醇組神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性率和微管相關(guān)蛋白分化率更高，說(shuō)明相較于神經(jīng)生長(zhǎng)因子，β-巰基乙醇能夠更好地促進(jìn)BM-MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化?；诖?，本研究利用化學(xué)誘導(dǎo)劑β-巰基乙醇誘導(dǎo)大鼠BM-MSCs向神經(jīng)元樣定向分化，誘導(dǎo)7 d后，細(xì)胞逐漸向神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)分化，出現(xiàn)軸突樣類似物，細(xì)胞體收縮，遮光性增強(qiáng)。神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性細(xì)胞的陽(yáng)性率超過(guò)90%，說(shuō)明神經(jīng)元樣定向誘導(dǎo)分化較為成功，進(jìn)而將定向誘導(dǎo)分化的BM-MSCs注射入模型大鼠的坐骨神經(jīng)損傷處，另外設(shè)置普通BM-MSCs對(duì)照組。觀察12周后，證實(shí)普通細(xì)胞組和定向誘導(dǎo)組大鼠運(yùn)動(dòng)功能較模型組大鼠明顯改善，利用電生理檢測(cè)和拉伸實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，無(wú)論是注射BM-MSCs還是注射神經(jīng)元樣定向誘導(dǎo)分化的BM-MSCs，均具有恢復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)電生理學(xué)特性和拉伸力學(xué)性能的作用。而且坐骨神經(jīng)損傷處神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)因子（BDNF、MBP、GAP-43蛋白）的表達(dá)水平明顯升高。尤其是定向誘導(dǎo)組大鼠較普通細(xì)胞組大鼠SFI指數(shù)、BBB評(píng)分、坐骨神經(jīng)電生理學(xué)特性和拉伸力學(xué)性能改善更明顯，且BDNF、MBP、GAP-43蛋白表量更高，說(shuō)明BM-MSCs可以向神經(jīng)損傷點(diǎn)傳遞有助于功能恢復(fù)的關(guān)鍵信號(hào)，進(jìn)而改變細(xì)胞行為或轉(zhuǎn)移某些細(xì)胞因子以減輕損傷。而且神經(jīng)元樣定向誘導(dǎo)分化的BM-MSCs更有利于坐骨神經(jīng)損傷的恢復(fù)。

既往雖然眾多基礎(chǔ)研究證實(shí)，靜脈注射BM-MSCs可以調(diào)節(jié)局部環(huán)境，減少炎癥反應(yīng)，促進(jìn)小鼠坐骨神經(jīng)擠壓模型軸突再生[15];同時(shí)也可增加新生神經(jīng)纖維和神經(jīng)血管的數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)損傷的周圍神經(jīng)功能的恢復(fù)[16]。例如龔慶等[17]的研究顯示分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入外周神經(jīng)斷端時(shí)，可以促進(jìn)神經(jīng)纖維的再生，其作用機(jī)制與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷中的軸索再生與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)聯(lián)。但是隨著研究的深入，越來(lái)越多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)移植后BM-MSCs向膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分化的比率高于向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的比率[18]。以BM-MSCs為基礎(chǔ)的坐骨神經(jīng)損傷治療有兩個(gè)主要目的，一是為神經(jīng)元細(xì)胞提供微環(huán)境，以支持或增強(qiáng)損傷處細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)和再生能力;二是替換丟失或受損的神經(jīng)元。以往的許多研究表明，移植的BM-MSCs可促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌進(jìn)而對(duì)周圍神經(jīng)元再生起重要作用。然而誘導(dǎo)BM-MSCs向神經(jīng)元樣定向分化也是十分重要的。因此在本研究中，首先在體外利用化學(xué)誘導(dǎo)劑將BM-MSCs向神經(jīng)元定向誘導(dǎo)，再注射至動(dòng)物坐骨神經(jīng)損傷處，并得到了較為理想的治療效果。

GAP-43是一種熱穩(wěn)定的磷酸蛋白，當(dāng)神經(jīng)受到損傷時(shí)GAP-43表達(dá)開(kāi)始升高，能夠幫助受損傷的神經(jīng)再生、發(fā)育并加快結(jié)構(gòu)重建[19]。BDNF是一種促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元增殖和存活的分泌生長(zhǎng)因子，其與神經(jīng)元可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)有關(guān)。MBP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘中含量第二豐富的蛋白，負(fù)責(zé)致密多層髓鞘的細(xì)胞質(zhì)表面的黏附[20]。作為“內(nèi)在無(wú)序”或構(gòu)象適應(yīng)性蛋白家族的一員，它可以與肌動(dòng)蛋白、微管蛋白、網(wǎng)格蛋白等多陰離子蛋白以及帶負(fù)電荷的脂質(zhì)相互作用，并通過(guò)與它們結(jié)合而獲得結(jié)構(gòu)[21]。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞的BM-MSCs可以上調(diào)坐骨神經(jīng)損傷大鼠坐骨神經(jīng)組織中BDNF、MBP和GAP-43蛋白表達(dá)，說(shuō)明將BM-MSCs進(jìn)行神經(jīng)元樣定向誘導(dǎo)分化處理后，更有利于大鼠坐骨神經(jīng)的恢復(fù)，其可能的作用機(jī)制之一與BM-MSCs產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如BDNF、MBP、GAP-43等有關(guān)。

隨著社會(huì)的發(fā)展、交通事故傷害的增加，坐骨神經(jīng)損傷的發(fā)生率日漸增高，我們的研究證明定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞的BM-MSCs對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷具有明顯的修復(fù)效果，這為坐骨神經(jīng)損傷的治療提供了新的方向，并為最終過(guò)渡到臨床應(yīng)用提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2020-12-01）