衛(wèi)亞峰,毛銀,李國輝,鄧禹*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

大豆及其衍生物因富含蛋白質(zhì)、油脂、維生素和其他營養(yǎng)元素,被廣泛用于人類食品和動物飼料的生產(chǎn)[1],然而,大豆也是公認(rèn)的8大食物過敏原之一[2],嚴(yán)重影響了大豆食品的開發(fā)與應(yīng)用。β-伴大豆球蛋白是由α′(72 kDa),α(68 kDa)和β(52 kDa)亞基通過疏水相互作用組成的三聚體蛋白[3-4],占大豆7S球蛋白的85%,已被確認(rèn)為是最易致敏的大豆蛋白之一[5-6]。其中,β亞基含有相對較高的疏水性氨基酸[7],也是大豆蛋白的主要營養(yǎng)抑制劑之一[8]。另外,相對于α′和α亞基,β亞基具有更好的耐受性,在后處理過程中難以完全去除[9]。因此,基于β亞基的有效檢測可用于評估大豆中抗原蛋白的含量。

由于核酸適配體可折疊形成對靶分子具有高親和力和特異性的復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)[10],研究篩選獲得了針對β-伴大豆球蛋白β亞基的高特異性核酸適配體,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了高精確度的適配體傳感器,實現(xiàn)了對分離純化后獲得的β-伴大豆球蛋白β亞基的專一性檢測。然而實際的豆粕發(fā)酵樣品成分復(fù)雜[11],可能會影響適配體傳感器的檢測。而分離純化β-伴大豆球蛋白β亞基需要經(jīng)過7S球蛋白純化、β-伴大豆球蛋白分離純化、透析除鹽等步驟,嚴(yán)重限制了適配體傳感器的開發(fā)與應(yīng)用。

本研究基于β-伴大豆球蛋白β亞基的高特異性適配體生物傳感器,首先用堿性蛋白酶酶解模擬豆粕發(fā)酵,通過對比十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)驗證了該傳感器檢測實際樣品的可行性,在此基礎(chǔ)上對關(guān)鍵影響因素進(jìn)行分析,最后成功將該傳感器應(yīng)用于菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕中β-伴大豆球蛋白β亞基的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SynergyH1多功能檢測儀,美國BioTek有限公司；ST 16R高速冷凍離心機,美國賽默飛世爾科技公司；Master-S15實驗室純水系統(tǒng),上海和泰儀器有限公司；ChemiDoc XRS+多功能凝膠成像系統(tǒng)、LF-Mini4小型垂直電泳槽,美國Bio-Rad公司。

市售豆粕；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、溶菌酶、胰蛋白酶,生工生物工程(上海)股份有限公司；凝血酶、Tris、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),索萊寶生物科技有限公司；氯金酸、考馬斯亮藍(lán)R250、NaCl、甲醇、脲、鹽酸,國藥化學(xué)試劑有限公司；堿性蛋白酶(200 000 U/g),錫貝特生物科技有限公司；其他試劑均為分析純；適配體序列5′-AACACGACCACGCTGTGACGGACACAGGTTGGCA-GCGTCGTG-3′,金唯智生物科技(蘇州)有限公司；實驗操作過程中所用溶液均為超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)配制；通過苯基疏水柱子和凝膠層析柱(Superdex 200 column)分離純化得到純β-伴大豆球蛋白β亞基。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米金顆粒的制備

參考劉穎沙等[12]的檸檬酸三鈉還原法制備納米金(gold nanoperticles,AuNPs)。該方法制備的AuNPs顆粒最大吸收峰在520 nm處。

1.2.2 堿性蛋白酶水解豆粕

按1∶15的質(zhì)量比取粉碎豆粕和堿性蛋白酶溶液并充分混勻,使堿性蛋白酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%。置于搖床37 ℃振蕩30 min使其充分混勻。沸水浴10 min使堿性蛋白酶失去活性,12 000 r/min低溫離心10 min,取上清液備用。

6.逃避退縮的勉強適應(yīng)期。政策不斷調(diào)整，待遇逐漸改善，協(xié)解人員推翻協(xié)解事實的幻想因無望而基本放棄。他們的工作環(huán)境、生活水平的提升需求也一步步得到滿足，大部分協(xié)解人員決定勉強接納現(xiàn)狀，自覺尋求心理平衡，盡量維持適應(yīng)目前生活。

1.2.3 堿性蛋白酶固態(tài)發(fā)酵豆粕

按2∶1的質(zhì)量比將粉碎豆粕和堿性蛋白酶溶液充分混勻,使堿性蛋白酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、1%。置于37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h,烘干,粉碎。將粉碎好的不同酶濃度固態(tài)發(fā)酵豆粕1 g分別溶于15 mL超純水中,置于搖床37 ℃振蕩30 min使其充分混勻,12 000 r/min低溫離心10 min,取上清液備用。

1.2.4 菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕

取粉碎好的豆粕20 g,1 mL對數(shù)生長期的乳酸菌DY6,超純水10 mL,堿性蛋白酶0.1 g于無菌自封袋中混合均勻,置于37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h,烘干,粉碎。將粉碎好的菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕1 g溶于15 mL超純水中,置于搖床37 ℃振蕩30 min使其充分混勻,12 000 r/min低溫離心10 min取上清液備用。

1.2.5 傳感器檢測實際樣品

參照付田等[13]的參數(shù)優(yōu)化方法對本實驗中NaCl和適配體濃度進(jìn)行優(yōu)化。檢測條件：100 μL AuNPs和20 μL 0.5 μmol/L的適配體溶液于96孔板中室溫避光反應(yīng)1 h,使適配體吸附在AuNPs顆粒上以保證其在低鹽環(huán)境中不聚集變色[14],隨后加入20 μL 0.3 mol/L的NaCl溶液,并立即加入20 μL β-伴大豆球蛋白β亞基于室溫孵育30 min,使其特異性結(jié)合適配體。用酶標(biāo)儀掃描450～650 nm的吸光值,記錄520和600 nm處的吸光值,根據(jù)吸光值A(chǔ)600/A520的變化對β亞基進(jìn)行定量分析。本研究對實際樣品進(jìn)行檢測時,用豆粕上清提取液取代方法中的β-伴大豆球蛋白β亞基。

為驗證適配體比色法檢測β-伴大豆球蛋白β亞基的特異性,按照1.2.5中方法分別用20 μL 0.3 μmol/L的牛血清蛋白、胃蛋白酶、溶菌酶、胰蛋白酶、凝血酶以及上述5種干擾蛋白的混合物代替β-伴大豆球蛋白β亞基。用酶標(biāo)儀檢測600和520 nm處吸光值,按照公式(1)計算干擾蛋白對傳感器的干擾率：

(1)

菌酶發(fā)酵豆粕蛋白的提取常引入蛋白提取液,但蛋白提取液成分復(fù)雜,有些成分還可能影響檢測結(jié)果,因此采用控制變量法對常用蛋白提取液成分進(jìn)行分析,排除影響適配體傳感器檢測結(jié)果的成分。排除方法如表1所示。

表1 蛋白提取液不同成分對傳感器檢測的影響 單位：μL

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器檢測實際樣品可行性分析

本研究首先以堿性蛋白酶溶液水解豆粕來模擬更為復(fù)雜的豆粕發(fā)酵過程,以驗證適配體比色傳感器檢測實際發(fā)酵豆粕樣品的可行性。豆粕經(jīng)過酶解前后樣品的吸收光譜圖如圖1所示,酶溶液處理后的豆粕最大吸收峰在530 nm左右,說明經(jīng)過酶溶液處理后的豆粕中β-伴大豆球蛋白β亞基含量很少,大部分核酸適配體依然吸附在AuNPs顆粒上防止其在特定鹽濃度條件下發(fā)生聚集,從而使AuNPs溶液呈紅色(樣品a)；用水處理的對照組豆粕曲線最大吸收峰在600 nm左右,說明豆粕中的β-伴大豆球蛋白β亞基沒有被降解。當(dāng)該豆粕提取液加入到AuNPs體系中,由于β亞基與其適配體的特異性結(jié)合力遠(yuǎn)大于適配體和AuNPs之間的電荷吸附力[15],使AuNPs失去核酸適配體的保護,體系中的NaCl就會破壞AuNPs之間的靜電斥力導(dǎo)致其發(fā)生聚集變色。以上結(jié)果表明,所構(gòu)建的適配體傳感器可以應(yīng)用于堿性蛋白酶水解豆粕樣品的檢測。

a-酶解后豆粕；b-酶解前豆粕圖1 豆粕酶解前后樣品溶液及其吸收光譜圖Fig.1 Solution and absorption spectrum of soybean meal sample before and after enzymolysis

2.2 實際樣品檢測的最佳濃度探究

參考AuNPs適配體傳感器的相關(guān)研究[13],將純化后的β-伴大豆球蛋白β亞基應(yīng)用于適配體傳感器,獲得A600/A520和β-伴大豆球蛋白β亞基濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.016 6x+0.297 5,檢測范圍為7～58 nmol/L?？紤]到豆粕中β-伴大豆球蛋白含量豐富且β亞基占據(jù)β-伴大豆球蛋白的20%左右[16],過高的β亞基濃度勢必會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,因此確定實際豆粕樣品檢測時的最佳濃度十分重要。對2.1中樣品b用超純水進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋后進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖2-a所示,隨著稀釋倍數(shù)的增大,樣品中β亞基濃度逐漸變小,最大吸收峰接近520 nm。圖2-b表示稀釋后上清提取液中β-伴大豆球蛋白β亞基濃度和A600/A520的關(guān)系圖。

a-吸收光譜圖；b-校準(zhǔn)曲線圖2 稀釋不同倍數(shù)豆粕提取上清液的吸收光譜圖和校準(zhǔn)曲線Fig.2 The absorption spectra and calibration curve of the extracted supernatants of soybean meal with different dilutions

當(dāng)稀釋倍數(shù)小于10時,A600/A520數(shù)值最高,表明該樣品不稀釋時上清液中的β亞基含量超出傳感器所檢測的范圍。而在稀釋倍數(shù)為10～50倍時稀釋倍數(shù)和A600/A520相關(guān)性良好,R2=0.94。所以，此品種豆粕在以下的實驗中均選用20倍稀釋。

2.3 酶固態(tài)發(fā)酵驗證

用堿性蛋白酶溶液處理豆粕,可使豆粕在短時間內(nèi)和堿性蛋白酶充分接觸,極大提高實驗效率。但是一方面不符合傳統(tǒng)發(fā)酵豆粕的工藝路線,另一方面可能會由于反應(yīng)太快,很難掌握豆粕發(fā)酵過程中抗原蛋白的真實變化情況。因此以不同濃度的堿性蛋白酶固態(tài)發(fā)酵豆粕,探究酶濃度對抗原蛋白β亞基降解率的影響。如圖3-a所示,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、1%的堿性蛋白酶分別發(fā)酵豆粕樣品(編號1～6)?？偟膩砜?在酶固態(tài)水解過程中,β-伴大豆球蛋白的α′和α亞基首先被降解,β亞基因酶耐受力較強而最后被降解。

M-蛋白Marker；泳道1-6分別代表樣品1-6； 泳道7,8代表純化的β亞基; a-SDS-PAGE分析；b-β亞基降解率關(guān)系圖圖3 堿性蛋白酶酶解β伴大豆球蛋白β亞基Fig.3 Hydrolysis of β-conglycinin β subunit with alkaline protease

當(dāng)堿性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到0.2%時,α′和α亞基基本被降解完全,而β亞基在堿性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時才基本被完全降解,這與ZHAO等[9]的研究結(jié)果相似。同樣將1.2.3中上清液通過適配體傳感器進(jìn)行檢測,經(jīng)過計算得到關(guān)于堿性蛋白酶濃度和β-伴大豆球蛋白β亞基降解率的關(guān)系見圖3-b。隨著堿性蛋白酶濃度增加,β亞基降解率也隨之增加,當(dāng)堿性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%左右時,β亞基降解率為100%,與SDS-PAGE結(jié)果相符合。此外,圖3-a泳道5基本檢測不到β亞基,但AuNPs傳感器依然檢測到20%左右的β亞基存留量,證明了AuNPs-適配體傳感器高靈敏度的特點[17]。

2.4 傳感器的特異性驗證

在對實際發(fā)酵豆粕進(jìn)行檢測時,豆粕上清提取液中復(fù)雜的環(huán)境對生物傳感器的特異性要求很高,良好的特異性可以有效避免“假陽性”,提高實驗的準(zhǔn)確度。本實驗分別對濃度過量(0.3 μmol/L)的BSA、胃蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、凝血酶、β-伴大豆球蛋白β亞基,以及以上6種蛋白的混合物進(jìn)行檢測。經(jīng)計算,BSA、胃蛋白酶、溶菌酶、胰蛋白酶、凝血酶、混合物對傳感器的干擾率分別為4.82%、2.33%、5.87%、5.14%、6.12%、109.45%(圖4)。這表明干擾蛋白不會和β-伴大豆球蛋白β亞基的適配體特異性結(jié)合,因此加入干擾蛋白的體系中,適配體可以有效保護AuNPs在低鹽環(huán)境中不聚集,這與之前的報道[18]相一致。以上結(jié)果表明,構(gòu)建的AuNPs-適配體傳感器可直接應(yīng)用于豆粕樣品的檢測。

圖4 AuNPs-適配體傳感器檢測β伴大豆球蛋白 β亞基的特異性分析Fig.4 Specificity analysis of β-conglycinin β subunit detected by AuNPs aptamer sensor

2.5 干擾性物質(zhì)排除

豆粕菌酶協(xié)同發(fā)酵過程常添加微生物、蛋白酶、糖蜜等物質(zhì),實際發(fā)酵過程中有機酸、小肽、蛋白大分子的含量會發(fā)生變化[19]。在不妨礙檢測結(jié)果的前提下,為使待檢測蛋白從固體發(fā)酵豆粕中更好地溶出以提高檢測效率,常常需要用蛋白提取液來推進(jìn)此過程。常用的蛋白提取液包含脲、Na2SO3、Tris-HCl和SDS。AuNPs適配體傳感器對檢測環(huán)境要求較高,在特定情況下微量鹽離子就可以使AuNPs聚集變色,影響實驗結(jié)果。采用表1控制變量方法對蛋白提取液常用成分進(jìn)行分析,結(jié)果如圖5所示,只有脲對檢測體系中的AuNPs幾乎無影響,其他3種成分皆對傳感器產(chǎn)生較大干擾。其中,Na2SO3溶液使AuNPs聚集變色、Tris-HCl溶液可使AuNPs最大吸收峰值變大且峰形產(chǎn)生明顯變化、SDS溶液使AuNPs最大吸收峰值顯著變小。故在后續(xù)蛋白提取的過程中應(yīng)避免使用以上3種成分。

圖5 蛋白提取液成分干擾分析Fig.5 Analysis of interference of protein extracting solution

2.6 菌酶協(xié)同發(fā)酵驗證

近年來,菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕因其對豆粕價值的顯著提升受到廣泛關(guān)注[20-21]。本研究參考毛銀等[19]菌酶協(xié)同方法發(fā)酵豆粕,結(jié)合AuNPs-適配體生物傳感器檢測豆粕發(fā)酵后β-伴大豆球蛋白β亞基的降解情況,從而評估菌酶協(xié)同發(fā)酵的效果。發(fā)酵前后豆粕各項指標(biāo)見表2,豆粕經(jīng)過菌酶協(xié)同發(fā)酵后粗蛋白含量、肽含量、總酸含量、β-伴大豆球蛋白β亞基降解率均有所提高。其中,菌酶協(xié)同方法發(fā)酵24 h豆粕樣品β亞基降解率為87.81%,較2.3中相同濃度堿性蛋白酶單獨發(fā)酵β亞基降解率提高了6.91%,且加入植物乳桿菌DY6還可以提高豆粕飼料的適口性和抑菌性,說明菌酶協(xié)同發(fā)酵優(yōu)于蛋白酶單獨發(fā)酵。綜上所述,AuNPs適配體傳感器同樣適用于菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕中β-伴大豆球蛋白β亞基的快速檢測。

表2 發(fā)酵前后豆粕各項指標(biāo)Table 2 Indexes of soybean meal before and after fermentation

3 結(jié)論

本研究將適配體傳感器應(yīng)用于發(fā)酵豆粕中β-伴大豆球蛋白β亞基的檢測,大大提高了檢測效率。相對于傳統(tǒng)的大豆抗原蛋白檢測方法,本方法操作簡單、靈敏度高、結(jié)果可靠且不需要昂貴的儀器設(shè)備。然而,大豆產(chǎn)品多種多樣,在今后的研究中,可以構(gòu)建諸如熒光傳感器、電化學(xué)傳感器、表面等離子共振傳感器等方法,進(jìn)一步拓寬適配體生物傳感器的應(yīng)用范圍,實現(xiàn)所有大豆產(chǎn)品中β-伴大豆球蛋白β亞基的有效檢測。