黃 榮, 姚 博, 張玉娟, 賈倩英, 李向陽(yáng), 張 宏, 張振粉*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)為豆科苜蓿屬多年生牧草，莖葉中含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)草量高等優(yōu)點(diǎn)，有“牧草之王”的美譽(yù)[1-3]。它不僅可以作為飼料作物，而且在改土肥田、保持水土和改善生態(tài)環(huán)境等方面也發(fā)揮著重要作用[4]。此外，紫花苜蓿是中國(guó)乃至世界上種植面積最大、種植范圍最廣的豆科牧草[5]。然而由于紫花苜蓿多種植在沒(méi)有灌溉條件的貧瘠地與低產(chǎn)田上[6]，其生產(chǎn)潛力受限無(wú)法充分發(fā)揮其價(jià)值，嚴(yán)重影響了苜蓿的經(jīng)濟(jì)利益和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[7]。因此，如何提高苜蓿在外界環(huán)境條件不適宜時(shí)的產(chǎn)量和質(zhì)量成為苜蓿產(chǎn)業(yè)化發(fā)展領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁(Gram negative bacteria,GNB)的主要組成成分[8]，也是一種重要的微生物相關(guān)分子模式(Microbe-associated molecular patterns,MAMPs)，它可以引起植物葉綠體損傷和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)迸發(fā)等反應(yīng)[9]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控過(guò)程中起到重要作用。研究表明從銅綠假單胞菌(Pseudomnasaeruginosa)中純化的10～50 mg·mL-1商用LPS可引發(fā)植物先天免疫反應(yīng)[10]和觸發(fā)擬南芥ROS的雙相產(chǎn)生[11]。前人對(duì)脂多糖的研究都集中在其對(duì)植物的致病能力的測(cè)定。種子、植物中分布著大量脂多糖，卻并未引發(fā)大規(guī)模的植物病害，因此推測(cè)脂多糖在低濃度時(shí)無(wú)致病功能。冷靜等[12]研究表明成團(tuán)泛菌的脂多糖(Pantoeaagglomeranslipopolysaccharide,LPSp)是一種低毒性、安全性良好和純度活性高的免疫增強(qiáng)劑，可以有效調(diào)節(jié)作物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程[13]。因此，探索不同濃度的脂多糖對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)的作用具有重要意義。

為此，本試驗(yàn)以紫花苜?！弈?51’品種為供試材料，測(cè)定了不同濃度成團(tuán)泛菌CQ10菌株脂多糖(CQ10-LPSp)對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)及苗期生長(zhǎng)的影響，以期為開(kāi)發(fā)具有促生性的外源添加脂多糖制劑提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株及紫花苜蓿品種

供試菌株成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)CQ10分離自紫花苜蓿種子，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院牧草病理實(shí)驗(yàn)室提供。

供試紫花苜蓿品種：紫花苜?！弈?51’(Medicagosativa‘Juneng 551’)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草種質(zhì)資源實(shí)驗(yàn)室提供，種樣在4℃恒溫條件下保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient agar,NA)[14]，主要用于成團(tuán)泛菌CQ10菌株的純化培養(yǎng)。

1.3 CQ10-LPSp的提取

CQ10菌株在NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48 h后，使用貝博生物科技有限公司BBproExtra脂多糖提取試劑盒，提取CQ10-LPSp，具體方法參照說(shuō)明書(shū)。

1.4 CQ10-LPSp的活性檢測(cè)

定量法鱟試劑測(cè)定CQ10-LPSp活性。具體參照GenScript的ToxinSensorTMEndotoxin Detection System試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作方法。

根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作方法得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。將3次測(cè)定樣品的平均值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得CQ10-LPSp活性為0.267 EU·mL-1。

圖1 LPS含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 種子發(fā)芽試驗(yàn)

1.5.1前期準(zhǔn)備 (1)參照《牧草種子檢驗(yàn)規(guī)程GB/T 2930.4-2001》[15]挑選籽粒飽滿、無(wú)病蟲(chóng)害的的干凈種子400粒，平均分為2組，各200粒。

(2)向玻璃發(fā)芽瓶中加入200 mL蒸餾水和不同濃度的(0，0.267，0.534和0.801 EU·mL-1)CQ10-LPSp，并記為CK(對(duì)照組)，A，B和C處理，高溫高壓滅菌鍋(121℃，0.11 Mpa)滅菌21 min后待用。

1.5.2發(fā)芽試驗(yàn) 種子分消毒組(消除種子表面微生物干擾)和未消毒組。其中消毒組采用質(zhì)量濃度為75%的酒精浸泡1 min，質(zhì)量濃度為3% NaClO浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗3～4次；未消毒組不作任何處理。

將處理好的種子等距置于上述滅好菌的發(fā)芽瓶的發(fā)芽床上，每瓶25粒，n=4。接入種子后將發(fā)芽瓶放置于溫度23℃、濕度45%、光照(18 Klux)18 h、黑暗6 h的生長(zhǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，期間需觀察對(duì)照組和處理組種子生長(zhǎng)狀態(tài)。于種子發(fā)芽第7 d測(cè)定發(fā)芽勢(shì)，第10 d測(cè)定發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，第30 d觀察紫花苜蓿幼苗根系結(jié)瘤情況并取樣測(cè)定幼苗根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)、鮮重、干重和根系形態(tài)指標(biāo)，并持續(xù)觀察剩余樣品的生長(zhǎng)情況。

1.5.3指標(biāo)測(cè)定 種子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)為胚根突破種皮，長(zhǎng)出0.3 cm左右長(zhǎng)的白色種根。

種子發(fā)芽率(Germination rate，GR)(%)=(第10 d發(fā)芽的種子數(shù)/25)×100%；發(fā)芽勢(shì)(Germination potential，GP)(%)=(第7 d發(fā)芽的種子數(shù)/25)×100%；發(fā)芽指數(shù)(Germination index，GI)=∑Gt/Dt(Gt：第t d天的發(fā)芽數(shù)；Dt：相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù))。

苗長(zhǎng)(Seedling length，SL)和根長(zhǎng)(Root length，RL)的測(cè)定：隨機(jī)從各處理中選取10株紫花苜蓿幼苗，測(cè)量幼苗從根基部到植株最高部位的絕對(duì)長(zhǎng)度為苗長(zhǎng)；測(cè)量根基部到根尖的長(zhǎng)度為根長(zhǎng)。

鮮重(Fresh weight，F(xiàn)W)和干重(Dry weight，DW)的測(cè)定：隨機(jī)從各處理中選取10株紫花苜蓿幼苗，濾紙吸干表面水分后稱其鮮重，測(cè)完鮮重后將幼苗放置烘箱，75℃烘48 h至恒重后稱重即為干重。

根系形態(tài)指標(biāo)是將紫花苜蓿幼苗根系從發(fā)芽瓶取出，蒸餾水中沖洗干凈，整理后用根系掃描系統(tǒng)掃描，輸出的圖片使用Win-RHIZO根系分析系統(tǒng)軟件(Regent Instruments Canada Inc)進(jìn)行分析，分別得出總根表面積(Surface area，SA，單個(gè)測(cè)量植株的所有根的面積，cm2)、總根體積(Root volume，RV，單個(gè)測(cè)量植株的所有根總體積，cm3)、平均根直徑(Average diameter，AD，單個(gè)測(cè)量植株的所有根的平均直徑，cm)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并作圖，數(shù)值用平均值表示；運(yùn)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)項(xiàng)Duncan法比較種子處理和CQ10-LPSp濃度及二者交互作用對(duì)種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響；采用t檢驗(yàn)效應(yīng)分析CQ10-LPSp處理下不同種子處理對(duì)種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

由圖2可知，隨著CQ10-LPSp濃度升高，消毒組和未消毒組紫花苜蓿種子的發(fā)芽均受到了抑制。A，B處理下消毒組種子發(fā)芽率比對(duì)照組分別降低4.00%，9.00%，C處理時(shí)種子發(fā)芽率為0；A，B，C處理下未消毒組種子發(fā)芽率分別降低4.00%，3.00%，10.00%。隨著CQ10-LPSp濃度升高，未消毒組種子發(fā)芽率差異不顯著，而消毒組發(fā)芽率在C處理時(shí)顯著降低，表明種子表面微生物使種子對(duì)脂多糖處理的響應(yīng)有顯著性差異。

圖2 紫花苜蓿在4個(gè)不同脂多糖濃度處理下的發(fā)芽率

由圖3可知，隨著CQ10-LPSp濃度升高，消毒組和未消毒組種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均降低。A處理下，消毒組發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)分別比CK降低了4.00%，4.40，比B處理和C處理分別高1.00%和5.88，93.0%和8.16；未消毒組發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)分別比CK降低了5.00%，9.23，比C處理升高了4.67%，8.16；消毒組發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)分別比未消毒組高7.00%，9.81。B處理下，消毒組發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)分別比CK降低了5.00%，14.21，比C處理高92.00%，32.85；未消毒組發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)分別比CK降低了9.67%，9.95；消毒組發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)比未消毒組分別高4.00%，2.69。C處理下，消毒組的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均是0，與其他處理存在顯著性差異(P<0.05)；未消毒組的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)分別比CK降低了9.67%，9.95；未消毒組發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)顯著高于消毒組(P<0.05)。

圖3 紫花苜蓿在4個(gè)不同脂多糖濃度處理下的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)

2.2 不同濃度CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿幼苗根系生長(zhǎng)的影響

如圖4所示，隨著CQ10-LPSp濃度的升高，消毒組和未消毒組的平均根直徑呈上升趨勢(shì)；總根表面積呈下降趨勢(shì)。A處理下，消毒組紫花苜蓿幼苗的根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)和平均根直徑分別較CK增加了2.20，2.00，0.01 cm；未消毒組分別較CK增加了0.31，1.12，0.03 cm；消毒組較未消毒組根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)分別增加了4.34，3.71，平均根直徑減小了0.04 cm。B處理下，紫花苜蓿幼苗根系表現(xiàn)為短粗狀，消毒組平均根直徑和總根體積分別較CK和A處理增加了0.27 cm，0.50 cm3，根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)和總根表面積顯著低于CK和A處理(P<0.05)；未消毒組平均根直徑和總根體積分別較CK和A處理增加了0.02 cm，0.46 cm3，根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)和總根表面積顯著低于CK和A處理(P<0.05)。C處理下，消毒組種子未萌發(fā)，未消毒組種子雖有萌發(fā)，但后期逐漸枯萎腐爛，因此未測(cè)得幼苗的苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)等指標(biāo)(生長(zhǎng)狀況見(jiàn)圖6-C和圖6-G)。結(jié)果表明0.267 EU·mL-1CQ10-LPSp會(huì)促進(jìn)消毒組和未消毒組紫花苜蓿幼苗的根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)，對(duì)根直徑和總根體積沒(méi)有影響；0.534 EU·mL-1CQ10-LPSp會(huì)增加紫花苜蓿的根直徑，降低其根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)。

圖4 紫花苜蓿在4個(gè)不同脂多糖濃度處理處理下的平均根直徑、總根體積、總根表面積、根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)

2.3 不同濃度CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿幼苗鮮重和干重的影響

如圖5所示，CQ10-LPSp在高濃度時(shí)對(duì)紫花苜蓿的生長(zhǎng)有抑制作用，但在低濃度(A處理)時(shí)，對(duì)未消毒組生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。A處理下，未消毒組鮮重和干重顯著高于CK，B和C(P<0.05)；未消毒組鮮重和干重高于消毒組。B處理下，未消毒組鮮重和干重均高于消毒組，且消毒組和未消毒組鮮重存在顯著性差異(P<0.05)。

圖5 紫花苜蓿在4個(gè)不同脂多糖濃度處理下的鮮重、干重

2.4 不同濃度CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿結(jié)瘤的影響

結(jié)果如圖6所示，添加不同濃度CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿幼苗結(jié)瘤的影響差異較大，其中僅A處理未消毒組幼苗根部結(jié)瘤。且結(jié)瘤時(shí)間大約為處理后第22～24 d，比對(duì)照提前約16～18 d。隨著生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，所結(jié)根瘤逐漸增多并變大(圖6-J)，但植株葉片伴有白化現(xiàn)象。

圖6 4個(gè)不同CQ10-LPSp濃度處理下紫花苜蓿幼苗結(jié)瘤情況

3 討論

3.1 CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的影響

糖類作為微生物、動(dòng)植物及人體細(xì)胞表面的重要組成部分，在生命體的生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用，可以調(diào)節(jié)植物的營(yíng)養(yǎng)傳輸、下胚軸伸長(zhǎng)、子葉綠化和芽的發(fā)育[16]。細(xì)菌細(xì)胞存在許多結(jié)構(gòu)特異的莢膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)、胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS)和脂多糖，在適應(yīng)環(huán)境和與寄主互作中起著重要的作用。這些糖類結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣且高度保守，可作為一種有效的抗原類化合物[17]。張文平等[18]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌胞外多糖(20～2 000 mg·L-1)對(duì)水稻種子根的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；向達(dá)兵等[19]研究了內(nèi)生真菌(Bionectriapityodes)多糖浸種對(duì)苦蕎種子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明當(dāng)所用內(nèi)生真菌多糖濃度為100 mg·kg-1時(shí)，對(duì)苦蕎株高有明顯的提高效果，但當(dāng)多糖濃度繼續(xù)升高時(shí)，其提高效果顯著下降，而當(dāng)濃度上升到800 mg·kg-1時(shí)，真菌多糖浸種處理有明顯的抑制效果。本試驗(yàn)首次證實(shí)，成團(tuán)泛菌脂多糖會(huì)影響紫花苜蓿種子的萌發(fā)和苗期的生長(zhǎng)。結(jié)果表明，隨著CQ10-LPSp濃度的升高，消毒組和未消毒組紫花苜蓿種子的發(fā)芽會(huì)受到抑制，其中發(fā)芽指標(biāo)包括發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，當(dāng)CQ10-LPSp濃度為0.267 EU·mL-1時(shí)，消毒組和未消毒組的種子發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率和對(duì)照無(wú)顯著差異，且紫花苜蓿幼苗的根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)和平均根直徑高于對(duì)照，未消毒組幼苗鮮重、干重和平均根直徑高于對(duì)照。當(dāng)CQ10-LPSp濃度為0.801 EU·mL-1時(shí)，會(huì)完全抑制消毒組種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)，這與前人的研究結(jié)果一致[18-19]。王娜等[20]認(rèn)為植物內(nèi)生菌提取物對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有明顯的調(diào)控效應(yīng)，并認(rèn)為外用植物內(nèi)生菌提取物必然會(huì)影響植株體內(nèi)某些激素的含量以及激素間的平衡。綜上，0.267 EU·mL-1CQ10-LPSp雖抑制了紫花苜蓿種子的發(fā)芽，但與對(duì)照無(wú)顯著差異，未消毒組單株紫花苜蓿根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)、平均根直徑、鮮重和干重均高于對(duì)照，所以0.267 EU·mL-1CQ10-LPSp總體上提高了紫花苜蓿的總產(chǎn)量。因此，推測(cè)LPS作為一種外源物質(zhì)，具有閾值效應(yīng)，對(duì)植物具有雙重作用，低濃度時(shí)會(huì)促進(jìn)紫花苜蓿的生長(zhǎng)和結(jié)瘤，高濃度時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致植株體內(nèi)的激素水平不平衡和活性氧過(guò)量產(chǎn)生而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象[11,21-22]?；诖耍?.267 EU·mL-1CQ10-LPSp具備作為一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的潛力。

3.2 CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿結(jié)瘤的影響

紫花苜蓿可以和根瘤菌共生固氮，其共生固氮體系是自然界中固氮效率較高的體系之一[23]，對(duì)改良土壤結(jié)構(gòu)、增加土壤肥力和氮肥的施用量、養(yǎng)畜、保持水土及美化環(huán)境都有良好的改善作用，對(duì)于保護(hù)環(huán)境和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展也具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。一氧化氮(Nitric oxide,NO)作為一種自由基反應(yīng)性氣體信號(hào)分子，在豆科植物根瘤菌共生體系的功能結(jié)瘤、共生固氮和響應(yīng)非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要的功能[24-26]。最近的研究表明，LPS可作為一種重要的生物類激發(fā)子可以誘導(dǎo)原生質(zhì)體產(chǎn)生大量的NO[27-28]。在根瘤菌與植物共生過(guò)程中，LPS在根瘤菌對(duì)根毛的吸附、根瘤及侵染結(jié)構(gòu)的形成保護(hù)細(xì)胞免受植物防衛(wèi)反應(yīng)的作用等方面都有重要的作用[29]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿根的結(jié)瘤影響差異較大，僅0.267 EU·mL-1CQ10-LPSp的未消毒組紫花苜蓿幼苗根會(huì)結(jié)瘤，其他試驗(yàn)組均無(wú)結(jié)瘤現(xiàn)象，推測(cè)出現(xiàn)該現(xiàn)象可能有兩個(gè)原因：一是CQ10-LPSp誘導(dǎo)紫花苜蓿原生質(zhì)體產(chǎn)生了NO，NO促使紫花苜蓿結(jié)瘤[27-28]，且NO的含量是控制結(jié)瘤的重要因素之一；二是種子表面消毒殺死了紫花苜蓿種子表面的一些腐生菌，其中包括根瘤菌，該方法破壞了紫花苜蓿種子表面微生物的微生態(tài)環(huán)境，使得紫花苜蓿幼苗分泌的黃酮類化合物無(wú)法作用于根瘤菌的結(jié)瘤基因從而表達(dá)信號(hào)分子-結(jié)瘤因子[30]，這一假設(shè)需要更進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)及苗期生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明隨著CQ10-LPSp濃度的升高，消毒組和未消毒組紫花苜蓿種子萌發(fā)受到不同程度地抑制。其中在0.267 EU·mL-1CQ10-LPSp處理下，種子發(fā)芽雖受到抑制，但與對(duì)照無(wú)顯著差異，未消毒組單株紫花苜蓿根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)、平均根直徑、鮮重和干重均高于對(duì)照，且根瘤形成時(shí)間比對(duì)照組提前約16～18 d，根瘤數(shù)量也大于對(duì)照組。所以0.267 EU·mL-1CQ10-LPSp處理可促進(jìn)未消毒組紫花苜蓿的生長(zhǎng)和結(jié)瘤，總體上提高了紫花苜蓿的總產(chǎn)量。