秦愛玲，梁丹

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

卵巢癌是較常見的婦科惡性腫瘤，據(jù)國際權(quán)威雜志CA Cancer J Clin發(fā)布2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，卵巢癌的新發(fā)病率和死亡率均排在婦科惡性腫瘤的第二位，僅次于宮頸癌[1]。

IL-18是IL-1細胞因子家族的一員，可通過促進天然免疫細胞增殖和激活，抑制各種腫瘤的反向發(fā)展，在抗腫瘤研究方面被廣泛研究[2]。在各種人腫瘤組織微環(huán)境中均有分泌型IL-18結(jié)合蛋白IL-18BP的表達，通過抑制IL-18的功能，限制其免疫治療的功效[3]。有報道稱，雖然IL-18BP可以表達于原代培養(yǎng)的卵巢癌細胞和患者的血清、腹水中，但在卵巢癌細胞系中沒有表達。IL-27是IL-12家族成員，可以抑制多種腫瘤細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[4-8]，還可通過活化STAT1促進卵巢癌細胞系中IL-18BP的mRNA轉(zhuǎn)錄[9]。然而，IL-18BP在卵巢癌中的作用尚不明確。作為關(guān)鍵的免疫檢查點，程序性死亡配體1(PD-L1)通過與其受體-細胞膜上的程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)相互作用來抑制抗腫瘤免疫。阻斷PD-L1/PD-1相互作用可顯著增強抗腫瘤免疫應(yīng)答，是癌癥治療的重大突破。對PD-1和PD-L1的阻斷可以適當(dāng)激活NK細胞和CD8陽性T細胞，提高對卵巢癌免疫治療的效果[10]。在卵巢癌中IL-27也可以通過激活JAK-STAT通路，上調(diào)PD-L1的表達[11]。

本文將深入探討IL-18BP與卵巢癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)，分析PD-L1與IL-18BP之間可能存在的相互作用關(guān)系，為更好地解析 IL-18BP對卵巢癌發(fā)病的影響提出可信的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)資料來源與分組處理 本研究數(shù)據(jù)來源于UCSC網(wǎng)站(http://xena.ucsc.edu/)整理的TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中卵巢癌樣本信息(GDC TCGA Ovarian Cancer)以及GTEx數(shù)據(jù)庫中(https://www.gtexportal.org/home/index.html)正常卵巢樣本信息，包括卵巢癌樣本和正常卵巢樣本的全基因轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果(RNA-seq)、卵巢癌患者的總生存時間文件(survival data)以及臨床性狀信息文件(Phenotype)。將TCGA與GTEx下載的RNA-seq數(shù)據(jù)均進行Log2(FPKM+1)轉(zhuǎn)換。進行數(shù)據(jù)篩選，最終納入該研究共有354例卵巢癌樣本和88例正常卵巢樣本，后續(xù)臨床因素分析過程中由于TCGA數(shù)據(jù)庫存有部分患者臨床信息有缺失，故分析總例數(shù)有出現(xiàn)小于354例的情況。在納入的卵巢癌患者樣本中以IL-18BP的中位值進行分組，分為IL-18BP高表達組和IL-18BP低表達組，并利用此分組標準進行Kaplan-Meier生存分析和GSEA基因集富集分析。

1.2GSEA基因集富集分析 通過利用GSEA 3.0版本軟件對納入的卵巢癌樣本進行基因富集分析，根據(jù)IL-18BP中位值進行表達高低分組，研究IL-18BP表達水平與腫瘤經(jīng)典Hallmarks基因集和通路常用京都基因和基因組百科全書通路基因集(KEGG)的相關(guān)性。從Molecular Signatures Database數(shù)據(jù)庫中下載h.all.v7.2.symbols和c2.cp.kegg.v7.2.symbols基因集作為參照基因集，軟件參數(shù)設(shè)置排列次數(shù)為1000次，計算富集分數(shù)和標準化后的富集分數(shù)。按照標準化后富集分數(shù)進行排序，將P<0.05，F(xiàn)DR<0.05的基因集作為顯著富集基因集。

1.3篩選在卵巢癌中和PD-L1表達正相關(guān)且與預(yù)后相關(guān)的基因 利用TCGA數(shù)據(jù)庫中卵巢癌的RNA-seq數(shù)據(jù)，采用Pearson分析篩選與PD-L1表達相關(guān)基因，篩選條件為P<0.05，|R|>0.5；通過Kaplan-Meier生存曲線分析與多因素Cox(multiCox)分析篩選與卵巢癌獨立預(yù)后基因；通過秩和檢驗篩選卵巢癌樣本和正常卵巢樣本間的差異基因；利用韋恩圖(Venn)在線網(wǎng)頁工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)篩選出滿足和PD-L1表達相關(guān)、可作為卵巢癌患者獨立預(yù)后且在腫瘤和正常樣本間具有表達差異的基因。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 卵巢癌中與PD-L1表達相關(guān)的基因采用Pearson分析；篩選卵巢癌與正常樣本的差異基因使用R語言軟件4.0.2版本“l(fā)imma”包，通過Wilcox秩和檢驗比較mRNA的表達水平；篩選獨立預(yù)后因素使用R語言軟件4.0.2版本“survival”包和“survminer”包，繪制Kaplan-Meier生存曲線和多因素Cox(multiCox)分析結(jié)果森林圖；IL-18BP mRNA表達水平和臨床性狀信息相關(guān)性分析采用χ2檢驗。IL-18BP與PDL1表達對卵巢癌患者預(yù)后的影響通過Kaplan-Meier繪制生存曲線。P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。Pearson判斷顯著性的|R|標準為>0.5，GSEA判斷富集顯著FDR值標準為<0.05。

2 結(jié)果

2.1IL-18BP在卵巢癌患者中的表達差異和生存分析 利用TCGA數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析，對88例正常卵巢組織樣本和354例卵巢癌樣本的IL-18BP mRNA表達進行分析(見圖1a)，IL-18BP基因在腫瘤組織樣本中和正常卵巢組織樣本中表達水平統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.05)，且IL-18BP在卵巢癌中的mRNA表達低于正常卵巢組織。

結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫中IL-18BP表達譜數(shù)據(jù)和生存數(shù)據(jù)，按照IL-18BP中位值分為高低表達兩組患者，進行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示IL-18BP高表達組相對于低表達組患者生存時間顯著延長(P<0.05)(見圖1b)；結(jié)合患者臨床性狀分析進一步進行多因素Cox分析，具有完整年齡、腫瘤分期、腫瘤分級以及IL-18BP表達量的患者共339例，結(jié)果顯示IL-18BP和年齡可作為卵巢癌患者獨立預(yù)后因素(圖1c)，IL-18BP為獨立保護性預(yù)后因素(HR=0.75，P<0.05)，年齡為獨立危險性預(yù)后因素(HR=1.02，P<0.05)。

注： 圖1a：TCGA數(shù)據(jù)庫卵巢癌樣本與GTEX數(shù)據(jù)庫正常卵巢樣本IL-18BP mRNA水平表達差異；圖1b：TCGA數(shù)據(jù)庫卵巢癌患者總生存KM曲線分析；圖1c：TCGA數(shù)據(jù)庫卵巢癌患者多因素Cox分析森林圖。

2.2卵巢癌中IL-18BP基因表達水平和臨床性狀的關(guān)系 結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫中卵巢癌樣本IL-18BP的表達譜數(shù)據(jù)和臨床性狀數(shù)據(jù)，具有完整年齡、腫瘤分期、腫瘤分級以及IL-18BP表達量的患者339例。利用χ2檢驗分析IL-18BP表達和臨床性狀的關(guān)系(見表1)，結(jié)果顯示IL-18BP表達僅與腫瘤分期有關(guān)，IL-18BP的高表達和低表達在腫瘤分期方面比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與年齡(P=0.706)、腫瘤分級(P=0.064)無關(guān)。

表1 IL-18BP的mRNA表達水平和卵巢癌患者臨床性狀的關(guān)系

2.3IL-18BP的功能基因集富集 為了進一步研究IL-18BP在卵巢癌中發(fā)揮的作用機制，利用TCGA數(shù)據(jù)庫中卵巢癌全基因組mRNA表達譜數(shù)據(jù)，通過GSEA方法分析IL-18BP的表達和腫瘤相關(guān)基因集與通路基因集之間的關(guān)聯(lián)。在Hallmarks基因集庫中，IL-18BP高表達組主要富集到細胞凋亡、補體系統(tǒng)、IL2/STAT5信號、同種異體排斥、炎癥應(yīng)答和干擾素γ應(yīng)答等相關(guān)的基因集(見圖2a)；在KEGG基因集庫中，IL-18BP高表達組主要富集到趨化因子信號通路、自然殺傷細胞細胞毒活性、T細胞受體信號通路、細胞凋亡、細胞因子受體相互作用和JAK/STAT信號通路等相關(guān)的基因集(見圖2b)。上述富集結(jié)果提示IL-18BP最有可能通過上述機制調(diào)控卵巢癌的進展。

注： 圖2a：IL-18BP在Hallmarks基因數(shù)據(jù)集中GSEA富集分析結(jié)果；圖2b：IL-18BP在KEGG基因數(shù)據(jù)集中GSEA富集分析結(jié)果。

2.4卵巢癌中篩選和PD-L1表達相關(guān)且與預(yù)后相關(guān)的基因 通過TCGA數(shù)據(jù)庫中卵巢癌樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)，對全基因組和PD-L1的mRNA表達進行Pearson相關(guān)性分析篩選，篩選條件設(shè)定為P<0.05，|R|>0.5，共篩選出355個基因；結(jié)合TCGA卵巢癌樣本的RNA-seq表達譜數(shù)據(jù)和相應(yīng)的患者總生存時間與生存狀態(tài)，利用Kaplan-Meier生存分析共篩選出3699個基因和卵巢癌患者生存相關(guān)，進一步對3699個基因利用多因素Cox篩選共篩選出25個基因，可作為卵巢癌患者獨立預(yù)后因素，通過分析結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)25個基因HR值均<1，表明上述基因為卵巢癌患者的獨立預(yù)后保護因素；最后通過TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析，共篩選出8083個差異基因。根據(jù)上述篩選條件，利用韋恩圖對每一篩選條件所篩選出的基因進行取交集，得出共有兩個基因滿足上述條件，分別為IL-18BP和AC083862.02(見圖3a)。利用GEPIA在線分析工具(http://gepia.cancer-pku.cn/)顯示IL-18BP與PD-L1的mRNA表達水平在卵巢癌中具有正相關(guān)(見圖3b)。

注： 圖3a：經(jīng)相關(guān)性、臨床預(yù)后及差異基因篩選基因；圖3b：TCGA數(shù)據(jù)庫IL-18BP與CD274 mRNA表達水平相關(guān)性分析。

2.5IL-18BP和PD-L1對卵巢癌患者預(yù)后的綜合分析 同時分析TCGA數(shù)據(jù)庫中卵巢癌患者中IL-18BP和PD-L1的表達，按照IL-18BP和PD-L1各自中位值可將卵巢癌患者分為4組(見表2)，結(jié)合相應(yīng)的總生存時間和生存狀態(tài)通過Kaplan-Meier生存分析(見圖4)，結(jié)果顯示IL-18BP和PDL1均高表達組較IL-18BP和PDL1均低表達組生存時間顯著延長(P<0.05)。

表2 按照IL-18BP和PD-L1各自中位值將卵巢癌患者分組

圖4 IL-18BP與PD-L1表達對卵巢癌患者總生存的KM曲線分析

3 討論

免疫系統(tǒng)和癌癥之間的相互作用由復(fù)雜的生物信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。盡管人們期望免疫系統(tǒng)會根據(jù)其獨特的突變和適應(yīng)特征，自動將癌細胞定義為“外來者”細胞并將其清除，然而免疫系統(tǒng)和癌癥之間最重要的自然平衡是“耐受性”，即癌細胞被視為“自己人”。這種耐受性由多種機制維持，包括調(diào)節(jié)性免疫細胞、免疫抑制性細胞因子和趨化因子，以及下調(diào)免疫功能的免疫檢查點[12-13]。PD-L1是最常見的免疫檢查點，與PD-1形成受體-配體對，是腫瘤微環(huán)境中主要的免疫檢查點通路。雖然理論上阻斷該通路可以提高免疫細胞對腫瘤細胞的識別并加以清除，但這種阻斷并非對每一種類型的腫瘤或每一個患者都有效[14]。已知除了PD-L1，還有CTLA4、IL-18BP等幾十個免疫檢查點。

IL-18是IL-1細胞因子家族的重要成員，介導(dǎo)NLRP3和NLRP1炎性小體下游的炎癥反應(yīng)[15]。IL-18是一種促炎和免疫調(diào)節(jié)細胞因子，其中還包括 IL-1α 和 IL-β、IL-33、IL-36α、IL-β、γ、IL-1Rα、IL-36Rα和IL-38[16]。與該家族的其他成員一樣，IL-18 需要被Caspase-1加工后成為活體形式。IL-18BP是IL-18的可溶性抗體，最初是從人的尿液中被發(fā)現(xiàn)，在體外和體內(nèi)阻斷IL-18誘導(dǎo)的IFN-γ產(chǎn)生，表明IL-18BP是IL-18介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的天然負向調(diào)節(jié)因子[17]。多項研究表明，IL-18BP可以通過中和IL-18抑制其抗腫瘤作用[18-19]，提示IL-18BP具有促癌的作用。然而，我們在對卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-18BP對于卵巢癌患者可能起到一個保護作用，主要體現(xiàn)為它的表達與患者的生存率呈正相關(guān)性(見圖1b)，并且可以作為獨立保護性因素存在(見圖1c)。在分析IL-18BP與卵巢癌患者臨床信息時發(fā)現(xiàn)，IL-18BP的表達水平與卵巢癌的臨床分期有關(guān)(見表1)。以上結(jié)果均提示：在卵巢癌中，IL-18BP可能是一個保護性因子。

PD-L1是最常見的免疫檢查點，與其配體PD-1結(jié)合可一定程度上抑制機體的細胞免疫反應(yīng)，特別是可以造成腫瘤細胞逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷，也就是免疫逃避。大多數(shù)研究認為PD-L1是一種跨膜蛋白，主要表達在細胞膜上。但深入研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1不僅表達在細胞膜，還可能存在于外泌體和細胞微泡表面，甚至部分以游離形式存在，這些非細胞膜上的PD-L1統(tǒng)稱為可溶性PD-L1[20]。雖然有報道稱，阻斷PD-1和PD-L1可以適當(dāng)激活NK細胞和CD8陽性T細胞，提高對卵巢癌免疫治療的效果[10]，但仍有報道稱，Stat3磷酸化介導(dǎo)的PD-L1入核卻可以通過誘導(dǎo)包括肺癌、乳腺癌、肝癌以及卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤細胞焦亡，顯著增強抗腫瘤免疫應(yīng)答[21]。以上結(jié)果提示：PD-L1在細胞內(nèi)不同的定位決定其完全不同的生物學(xué)功能。我們利用生物信息學(xué)分析卵巢癌中與PD-L1的相關(guān)基因表達時，發(fā)現(xiàn)IL-18BP與PD-L1具有最強的正相關(guān)性(見圖3b)。對卵巢癌患者的生存率分析發(fā)現(xiàn)，雖然PD-L1的表達高低對患者生存率有一定影響，但主要的影響因素還是IL-18BP(見圖4)。我們設(shè)想IL-18BP的這種對卵巢癌的保護作用可能是細胞核內(nèi)的PD-L1在發(fā)揮作用，在今后的研究中我們將繼續(xù)利用分子生物學(xué)手段進行進一步的研究證明。

綜上所述，與其它腫瘤不同的是，IL-18BP對于卵巢癌患者可能起到一個保護作用，而這種保護作用決定于PD-L1在細胞中的定位。本研究提出的設(shè)想可能為解釋IL-18BP在卵巢癌中的全新應(yīng)用提供新的思路。