馬青，楊揚(yáng)，馬韜，徐衛(wèi)東，趙明

(1. 江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 上海計(jì)劃生育科學(xué)研究所，上海 200032； 3. 上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院普外科，上海 200025)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染可誘發(fā)肝癌，導(dǎo)致全球每年超過(guò)100萬(wàn)人死亡[1]。HBV閉合環(huán)狀DNA合成下一代病毒RNA[2]，前基因組RNA編碼HBV聚合酶和HBV核心蛋白(HBV core protein, HBc)[3]，病毒逆轉(zhuǎn)錄酶合成HBV基因組的負(fù)鏈[4]。HBV基因組編碼4個(gè)開(kāi)放閱讀區(qū)：P、C、S、X，其中P基因編碼病毒聚合酶，C基因編碼核衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白以及HBV核心抗原(HBeAg)，S基因編碼3種不同的包膜糖蛋白，包括HBV表面抗原(HBsAg)，而X基因編碼多功能X蛋白[1]。HBV主要治療藥物是核苷酸類(lèi)似物，如拉米夫定和恩替卡韋，其中，拉米夫定主要通過(guò)抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性抑制HBV產(chǎn)生[5-6]，而恩替卡韋對(duì)HBV聚合酶具有很高的選擇性，長(zhǎng)期服用可能造成患者肝損傷。全蝎(ButhusmartensiiKarsch)及蜈蚣(ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch)作為廣譜性抗病毒中藥材，從中提取的某些毒性肽具有抗病毒作用[7-9]。以往研究表明，全蝎和蜈蚣的活性多肽的分子量分別集中在5～10 kDa和5 kDa以下兩個(gè)主要區(qū)域[10-12]。肝癌HepAD38細(xì)胞在誘導(dǎo)型四環(huán)素啟動(dòng)子的控制下可以產(chǎn)生HBV，當(dāng)去除細(xì)胞培養(yǎng)液中四環(huán)素后，可誘導(dǎo)HBV RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。目前，全蝎和蜈蚣的多肽是否具有抗HBV活性尚不清楚。因此，本研究擬通過(guò)對(duì)全蝎尾部提取的5～10 kDa多肽(PEST)和蜈蚣頭部提取的5 kDa以下多肽(PECH)2個(gè)組分與HepAD38細(xì)胞體外共培養(yǎng)，行抗HBV活性研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑及儀器

全蝎和蜈蚣購(gòu)自江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院趙明主任中藥師完成樣本鑒定。肝癌HepAD38細(xì)胞、HepG2細(xì)胞均由上海計(jì)劃生育科學(xué)研究所分子實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。

DMEM、Trizol(美國(guó)Thermo Fisher公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；100×青霉素/鏈霉素溶液(上海源培生物科技股份有限公司)；四環(huán)素(睿鉑賽生物科技有限公司)；MTT(上海生工生物工程有限公司)；微型分光光度計(jì)ASP-3700(美國(guó)ACTGene公司)；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；PBST(澳大利亞Devondale公司)；PVDF膜、GAPDH(美國(guó)Abcam Biotechnology公司)；鼠抗HBc，兔抗GAPDH，山羊抗兔或抗鼠IgG(美國(guó)Cell Signaling 公司)；化學(xué)發(fā)光試劑(北京Key-Bio公司)；RT-6500酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)；HBV核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量試劑盒(中美生物技術(shù)公司)；HBsAg診斷試劑盒(萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司)；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(德國(guó)天根生化科技公司)；Light Cycle 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)Roche公司)；Tanon-5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；二甲基亞砜、拉米夫定、恩替卡韋均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其余生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepAD38細(xì)胞培養(yǎng)于含DMEM、10%胎牛血清、100×青霉素/鏈霉素溶液和6.86 μmol/L四環(huán)素的培養(yǎng)基中。HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)四環(huán)素的相同培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為溫度37 ℃，含5% CO2。

1.3 多肽提取物制備及濃度與重金屬測(cè)定

取全蝎尾部與蜈蚣頭部，用0.5 mL PBS清洗3次；加入0.2×PBS于4 ℃勻漿；4 ℃，2 000×g離心30 min、離心2次收集上清液；5 000×g，4 ℃超濾10 min；加入200 μL PBS重復(fù)超濾3次；分別收集全蝎5～10 kDa超濾液，蜈蚣5 kDa以下超濾液；于-80 ℃保存2 h；用冷凍干燥器濃縮至1/5；濃縮液以4 ℃、2 000 ×g離心20 min，收集上清液；全蝎和蜈蚣的多肽提取物分別命名為PEST和PECH。多肽濃度直接通過(guò)微型分光光度計(jì)測(cè)量，取部分送由中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所測(cè)定重金屬含量。剩余于-80 ℃保存。

1.4 細(xì)胞活力與HBV DNA含量檢測(cè)

1.4.1 細(xì)胞分組和處理 HepAD38細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)48 h。細(xì)胞分組如下：對(duì)照組采用空白培養(yǎng)基培養(yǎng)；PEST組：分別用0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST處理；PECH組：分別用0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PECH處理；陽(yáng)性對(duì)照組：0.250 μmol/L拉米夫定或0.010 μmol/L恩替卡韋或6.860 μmol/L四環(huán)素；培養(yǎng)48 h。更換含上述藥物培養(yǎng)基或空白培養(yǎng)基，再培養(yǎng)72 h，收集上清液保存于-80 ℃用于HBV DNA測(cè)定，其余用于細(xì)胞活力測(cè)定。HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)12 h，細(xì)胞分組如下：對(duì)照組采用空白培養(yǎng)基培養(yǎng)；PEST組：分別用0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST處理；PECH組：分別用0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PECH處理；分別培養(yǎng)24、48、72 h，用于細(xì)胞活力測(cè)定。篩選PEST和PECH活性濃度范圍。

1.4.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 培養(yǎng)板中每孔加入90 μL培養(yǎng)基和10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，孵育4 h；加入150 μL DMSO，振蕩10 min以溶解結(jié)晶；用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處光密度(D)值。細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組D值-調(diào)零孔D值)/對(duì)照組D值-調(diào)零孔D值)×100%。

1.4.3 qRT-PCR檢測(cè)HBV DNA含量 從HepAD38細(xì)胞上清液中提取HBV DNA；qRT-PCR檢測(cè)：18.8 μL HBV PCR反應(yīng)液+0.2 μLTaq酶+0.03 μL尿嘧啶-N-糖基化酶，混合均勻后取19 μL分裝入PCR管，加入1 μL待測(cè)樣本DNA，共20 μL總反應(yīng)體系；37 ℃反應(yīng)5 min，95 ℃變性3 min，接著95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，50個(gè)循環(huán)。羧基熒光素檢測(cè)通道(FAM)收集信號(hào)，60 ℃收集數(shù)據(jù)。HBV DNA拷貝數(shù)用不同濃度HBV標(biāo)準(zhǔn)品制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量。

1.5 HBV抗原含量、mRNA相對(duì)表達(dá)以及HBc含量檢測(cè)

1.5.1 細(xì)胞分組和處理 HepAD38細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)48 h。對(duì)照組采用空白培養(yǎng)基培養(yǎng)；PEST組和PECH組分別用1 mg/mL PEST、PECH處理；陽(yáng)性對(duì)照組：0.250 μmol/L拉米夫定或0.010 μmol/L恩替卡韋或6.860 μmol/L四環(huán)素；培養(yǎng)48 h；更換相應(yīng)培養(yǎng)基再培養(yǎng)72 h。取上清液檢測(cè)HBsAg和HBeAg含量，細(xì)胞用于qRT-PCR檢測(cè)X/S/preC/PmRNA相對(duì)表達(dá)和HBc表達(dá)。

1.5.2 ELISA法檢測(cè)HBsAg和HBeAg含量 檢測(cè)HBsAg時(shí)， 每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液各50 μL，樣本孔中加入樣本溶液各10 μL和稀釋液40 μL，再加入100 μL檢測(cè)抗體，封閉，于37 ℃孵育60 min；檢測(cè)HBeAg時(shí)，樣品孔和陰性對(duì)照設(shè)3個(gè)復(fù)孔，陽(yáng)性對(duì)照設(shè)2個(gè)復(fù)孔，相應(yīng)孔中加入待測(cè)溶液各50 μL和酶標(biāo)試劑50 μL，封閉，于37 ℃孵育30 min。兩種微孔板均洗滌5次，毎孔加入A液、B液各50 μL，于37 ℃孵育15 min，加終止液50 μL，立即用酶標(biāo)儀以雙波長(zhǎng)450 nm/600～650 nm進(jìn)行檢測(cè)。具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。計(jì)算HBsAg和HBeAg的相對(duì)含量：相對(duì)含量(%)=(實(shí)驗(yàn)組D值-調(diào)零孔D值)/對(duì)照組D值-調(diào)零孔D值)×100%。

1.5.3 qRT-PCR檢測(cè)X、S、preC、P等mRNA相對(duì)表達(dá) 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系共20 μL，RNA 2 μL，5×gDNA緩沖液2 μL ,快速逆轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶混合物1 μL，F(xiàn)Q-逆轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物2 μL，無(wú)RNA酶的雙蒸水11 μL，操作方法參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。qRT-PCR反應(yīng)體系共20 μL：羅氏緩沖液10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各2 μL，加無(wú)菌水至20 μL。qRT-PCR引物序列：X基因上游為5′-TGCGCAGACCAATTTATGC-3′，下游為5′-CTCAGCAATGTCAACGACC-3′；S基因上游為5′-GGTAGGAGCTGGAGCATTCG-3′，下游為5′-GTAGGCTGCCTTCTTGACTG-3′；preC基因上游為5′-GGAGCTACTGTGGAGTTACTCTC-3′，下游為5′-TGTTCAAG CCTCCAAGCTGT-3′；P基因上游為5′-TTGTGG GTCTTTTGGGTTTTG-3′，下游為5′-GTTGGCGAG AAAGTGAAAGC-3′；GAPDH基因上游為5′-CAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，下游為5′-AGGTGGAGGAGTGGGTG-3′。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，40 ℃ 10 s，共35個(gè)循環(huán)。樣本mRNA Ct值通過(guò)GAPDH的Ct值均一化，即ΔCt=Ct樣本-Ct內(nèi)參，樣本基因mRNA相對(duì)豐度值以2-ΔΔCt值表示。

1.5.4 蛋白印跡法檢測(cè)HBc表達(dá) 取“1.5.1”細(xì)胞，加入上樣緩沖液于100 ℃煮10 min，冰上冷卻2 min；10 000 r/min、4 ℃離心2 min；行SDS-PAGE，90 V 1 h；200 mA 2 h轉(zhuǎn)印至PVDF膜；用含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉1 h；放入一抗稀釋液(小鼠HBc抗體，1 ∶1 000)，內(nèi)參稀釋液(兔GAPDH，1 ∶2000)，室溫孵育1 h；PBST洗膜4次，每次10 min；加入二抗(抗小鼠IgG 1 ∶10 000，或抗兔IgG 1 ∶3 000)孵育1 h；PBST洗膜4次，每次10 min；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，通過(guò)灰度掃描分析各蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 提取物多肽濃度與重金屬含量測(cè)定

PEST多肽濃度為6.000 mg/mL，PECH多肽濃度為5.600 mg/mL。重金屬檢測(cè)結(jié)果表明，PEST、PECH以及細(xì)胞培養(yǎng)基中的重金屬含量均在機(jī)器檢測(cè)誤差范圍內(nèi)，因此重金屬含量對(duì)細(xì)胞造成的影響可以忽略。見(jiàn)表1。

表1 各樣本的重金屬含量 mg/mL

2.2 PEST和PECH對(duì)HepAD38和HepG2細(xì)胞無(wú)毒性

由圖1可見(jiàn)，肝癌HepAD38和HepG2細(xì)胞活力在70%以上，各組之間未見(jiàn)顯著性差異，表明PEST和PECH對(duì)其沒(méi)有細(xì)胞毒性。在HepG2細(xì)胞中，48 h時(shí)，與對(duì)照組相比，0.250和0.500 mg/mL PEST組細(xì)胞活力顯著升高(t=3.26，3.31，P<0.05)，0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PECH組細(xì)胞活力顯著升高(P均<0.05)，與0.125 mg/mL組相比，0.250和0.500 mg/mL PEST組細(xì)胞活力顯著升高(t=4.67，3.35，P<0.05)；72 h時(shí)，與對(duì)照組相比，0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST組細(xì)胞活力顯著升高(P均<0.05)，1.000 mg/mL PECH組細(xì)胞活力顯著升高(t=2.25，P<0.05)，與0.125 mg/mL組相比，0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST組細(xì)胞活力顯著升高(P均<0.05)，1.000 mg/mL PECH組細(xì)胞活力顯著升高(t=4.21，P<0.05)。

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)0.125 mg/mL比較圖1 PEST和PECH分別對(duì)HepAD38和HepG2細(xì)胞活力的影響

2.3 PEST和PECH抑制HBV DNA復(fù)制

與對(duì)照組相比，0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST組和0.125、0.500、1.000 mg/mL PECH組HBV DNA拷貝數(shù)顯著降低(P<0.05或<0.01)。由此可見(jiàn)，特定濃度的PEST和PECH可抑制HBV DNA復(fù)制，其中1.000 mg/mL濃度作用下HBV DNA拷貝數(shù)最小，故選此濃度進(jìn)行后續(xù)抗HBV活性實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，四環(huán)素、恩替卡韋和拉米夫定組HBV DNA拷貝數(shù)較對(duì)照組顯著降低(P均<0.01)。見(jiàn)圖2。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對(duì)照組比較圖2 不同組HBV DNA拷貝數(shù)比較

2.4 PEST和PECH抑制HBsAg和HBeAg含量

與對(duì)照組相比，PEST組和PECH組HBsAg含量和HBeAg含量均顯著降低(P<0.05或<0.01)。由此可見(jiàn)，PEST和PECH可抑制HBV抗原分泌。同時(shí)，四環(huán)素、恩替卡韋和拉米夫定組HBsAg含量和HBeAg含量較對(duì)照組顯著降低(P<0.05或<0.01)。見(jiàn)圖3。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對(duì)照組比較圖3 不同組HBsAg和HBeAg含量比較

2.5 PEST和PECH降低HBV P mRNA相對(duì)表達(dá)

與對(duì)照組相比，PEST組和PECH組XmRNA相對(duì)表達(dá)顯著升高(t=11.86，P<0.01；t=4.75，P<0.05)；PEST組和PECH組S和preCmRNA相對(duì)表達(dá)無(wú)明顯變化。PEST組和PECH組PmRNA相對(duì)表達(dá)顯著降低(t=6.79，5.12，P均<0.05)；同時(shí)，四環(huán)素組X、preC和PmRNA，恩替卡韋組和拉米夫定組PmRNA相對(duì)表達(dá)顯著降低(P均<0.05)，拉米夫定組SmRNA相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對(duì)照組比較圖4 不同組HBV X/S/preC/P mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.6 PECH抑制HBc合成

與對(duì)照組相比，四環(huán)素組、拉米夫定組和PECH組HBc表達(dá)量顯著降低(P<0.05或<0.01)，恩替卡韋組HBc表達(dá)量顯著升高(t=22.17，P<0.01)，而PEST組HBc表達(dá)量無(wú)顯著性差異。由此可見(jiàn)PEST對(duì)HBc合成幾乎無(wú)影響，而PECH能抑制其合成。見(jiàn)圖5。

M：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)參照物；a：P<0.05，b：P<0.01，與對(duì)照組比較圖5 不同組HBV core蛋白表達(dá)量比較

3 討論

全蝎和蜈蚣的毒液是獨(dú)特的藥理資源，其中包含大量具有高度靶向功能的蛋白質(zhì)和多肽類(lèi)成分[13]。然而，獲取毒液困難且花費(fèi)高昂，本研究采用的提取多肽方法相對(duì)簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)。

抗HBV藥物也用于與HBV相關(guān)的肝細(xì)胞癌患者的輔助治療，顯著降低患者體內(nèi)病毒載量及活躍度，從而延緩病程的進(jìn)展和復(fù)發(fā)[14]。HepAD38屬于可以分泌HBV的肝癌細(xì)胞，HepG2屬于肝癌細(xì)胞，因此抗HBV作用也可以以細(xì)胞毒性的形式表達(dá)。PEST和PECH樣本中重金屬含量在正常范圍，本研究分別設(shè)置0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL濃度梯度的PEST組和PECH組以探索細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示二者對(duì)HepAD38和HepG2無(wú)細(xì)胞毒性。據(jù)報(bào)道，蜈蚣毒素肽在低濃度下可作為細(xì)胞生長(zhǎng)因子[15]，據(jù)此可以推測(cè)PECH類(lèi)似細(xì)胞生長(zhǎng)因子在低濃度下促進(jìn)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)。同樣在HepAD38細(xì)胞中探索0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL濃度梯度的PEST組和PECH組對(duì)HBV DNA拷貝數(shù)的影響。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，去除四環(huán)素后第5天HBV DNA拷貝數(shù)約為去除四環(huán)素后第2天的53倍，與其他研究一致[16]。由此表明，PEST和PECH可以抑制HBV DNA復(fù)制，其中1.000 mg/mL抑制效果最好。

抑制HBV復(fù)制必然減少HBsAg和HBeAg的分泌[17]，本研究結(jié)果證實(shí)PEST和PECH顯著抑制HBsAg和HBeAg分泌。此外，PEST和PECH使HBVPmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低。需要進(jìn)一步驗(yàn)證P蛋白表達(dá)顯著降低是否只是由于HBV的PmRNA特異性編碼HBV聚合酶[1,18]，沒(méi)有直接的結(jié)構(gòu)信息可用于P蛋白，但是P蛋白是從pgRNA翻譯而來(lái)的，pgRNA也可以作為HBc的mRNA，故進(jìn)一步分析HBc表達(dá)，結(jié)果表明PECH能抑制HBc表達(dá)。

由于多肽類(lèi)成分分離的復(fù)雜性，PEST和PECH樣本中多肽成分的分離純化有待進(jìn)一步研究。如果分離出有效單體化合物，將更好地發(fā)揮全蝎和蜈蚣的抗HBV價(jià)值。目前關(guān)于PEST和PECH抗HBV活性的研究?jī)H限于HepAD38細(xì)胞，還有待于使用動(dòng)物模型進(jìn)一步探索。

綜上所述，PEST和PECH具有良好的抗HBV活性，可以抑制HBV DNA復(fù)制、抑制HBsAg和HBeAg分泌，PECH可以抑制HBc合成。PEST和PECH在HepAD38細(xì)胞株中表現(xiàn)出抗HBV作用，可能與PEST、PECH抑制HBVPmRNA合成有關(guān)。