丁璟, 楊鑫鑫, 鄒雪琴， 高淑君， 劉雪， 潘玲麗，張?chǎng)q丹， 趙楊靜， 梁秀婷，王薈， 朱彥玲， 邵啟祥

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬徐州醫(yī)院婦產(chǎn)科， 江蘇 徐州 221005)

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長(zhǎng)度大于200 nt的RNA轉(zhuǎn)錄物，具有很少的蛋白編碼功能[1]。研究表明，lncRNA與多種生理和病理過(guò)程有關(guān)，尤其是癌癥的發(fā)生發(fā)展，其異常表達(dá)可致癌細(xì)胞不受細(xì)胞周期調(diào)控，無(wú)限增殖[2]。lncRNA可從基因的轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控，還調(diào)控DNA甲基化，重構(gòu)染色質(zhì)和組蛋白甲基化、乙?；缺碛^遺傳[3]。lncRNA常見(jiàn)的作用機(jī)制是通過(guò)海綿體吸附某些miRNA從而影響下游靶mRNA，構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)，從而調(diào)控基因的表達(dá)和功能的發(fā)揮[4]。但是，lncRNA在卵巢癌中發(fā)揮的生物學(xué)作用尚不清楚。本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選獲得在卵巢癌中具有顯著差異表達(dá)的lncRNA44372，其位于chr6:165773201-165773271。進(jìn)一步采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其生物學(xué)作用進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并運(yùn)用定量PCR驗(yàn)證其在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑與儀器

人卵巢癌細(xì)胞系HO8910，3AO，A2780，OVCR3以及卵巢上皮HOSEpiC細(xì)胞由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院周小明教授惠贈(zèng)；人卵巢癌SKOV3細(xì)胞由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院盧小東教授惠贈(zèng)。

DMEM，RPMI 1640，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；Trizol 試劑購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；異丙醇、氯仿、無(wú)水乙醇購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR ExTaqDNA聚合酶和SYBR?Premix ExTaqTMⅡ購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)水購(gòu)于上海生工生物工程有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；NanoDrop1000測(cè)定儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 下載數(shù)據(jù)庫(kù) 從NCBI GEO(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載基因芯片數(shù)據(jù)集。進(jìn)入NCBI網(wǎng)站，找到“GEO DataSets”搜索關(guān)鍵詞“ovarian tissue samples”，“normal”，“tumor”，點(diǎn)擊“search”，下載基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)GSE119054。它的基因芯片平臺(tái)是GPL19615 Agilent-067406 CBC lncRNA + mRNA microarray V4.0。

1.2.2 篩選在卵巢癌中差異表達(dá)的lncRNA 在腫瘤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)CRN(http:∥syslab4.nchu.edu.tw/index.jsp)中對(duì)來(lái)自NCBI GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中卵巢癌及正常組織樣本數(shù)據(jù)分析，以P<0.05，差異倍數(shù)1.2倍以上為條件，篩選出在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的lncRNA。

1.2.3 篩選與lncRNA44372作用的相關(guān)基因 通過(guò)在線工具Annolnc(http:∥annolnc.cbi.pku.edu.cn/)[5]篩選出可能與lncRNA44372表達(dá)水平相關(guān)的基因，并用互作分?jǐn)?shù)來(lái)表示共表達(dá)的強(qiáng)度。

1.2.4 lncRNA44372的GO分析和信號(hào)通路分析 利用在線工具David[6-7](https:∥david.ncifcrf.gov)對(duì)篩選出的共表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論分析(gene ontology，GO)及信號(hào)通路分析。

1.2.5 lncRNA44372的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)在線工具starbase(http:∥starbase.sysu.edu.cn/)研究lncRNA44372可靶向的miRNA分子和下游靶mRNA分子。利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA(http:∥gepia.cancer-pku.cn)研究靶mRNA分子在卵巢癌中的表達(dá)量。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng) 將卵巢癌SKOV3，HO8910，OVCR3和3AO細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，卵巢上皮細(xì)胞癌A2780細(xì)胞和卵巢上皮HOSEpiC細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.7 RNA提取 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的“1.2.6”細(xì)胞，以1×105密度接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至匯合度80%時(shí)取出；棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌2次；每孔加入1 mL Trizol 試劑，在冰上靜置5 min；用微量移液器小心吹打細(xì)胞使其脫落并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，加入200 μL氯仿，上下顛倒混勻5次，靜置5 min；于4 ℃ 12 000×g離心15 min；取上清液，加入500 μL異丙醇，上下顛倒混勻5次后靜置5 min；于4 ℃ 12 000×g離心10 min；棄上清液，每管加入75%乙醇1 mL漂洗沉淀；于4 ℃ 7 500×g離心5 min；棄去上清液后室溫干燥，每管加入適量DEPC水溶解RNA，用NanoDrop ND-1000測(cè)定RNA濃度和純度。

1.2.8 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件：37 ℃反應(yīng)15 min， 85 ℃反應(yīng)5 min，4 ℃得到cDNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)lncRNA44372表達(dá) 引物設(shè)計(jì)采用Primer 5.0軟件，β-肌動(dòng)蛋白上游引物序列為5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物序列為5′-ATACTCCTGCTTGCTGATC-3′；lncRNA44372上游引物序列為5′-TATTGCACTTGGACGGAGCA-3′，下游引物序列為5′-AAGGCAAGCAACTTGACACG-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以cDNA 0.5 μL為模板，上下游引物各0.2 μL，SYBR Premix ExTaqTMⅡ5.0 μL，滅菌水4.1 μL，配制10 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，根據(jù)熔解曲線形態(tài)判斷反應(yīng)的特異性，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌中差異表達(dá)的lncRNA

在腫瘤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)網(wǎng)站CRN中對(duì)來(lái)自NCBI GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)的卵巢癌樣本結(jié)果分析，其中根據(jù)表達(dá)量差異及P值發(fā)現(xiàn)，與卵巢正常組織相比，卵巢癌組織中表達(dá)上調(diào)的lncRNA有CROCCP2，lncRNA 00883，lncRNA00704，MCM3AP-AS1，DLEU2，NBLA00301；表達(dá)下調(diào)的lncRNA有l(wèi)ncRNA44372，lncRNA00657，RP11-890B15.3，TP73-AS1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)室前期芯片檢測(cè)結(jié)果[7]發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細(xì)胞系中有227個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào)，有483個(gè)lncRNA表達(dá)下調(diào)；結(jié)合基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)GSE119054選擇lncRNA44372作為研究對(duì)象。

2.2 與lncRNA44372作用相關(guān)的共表達(dá)基因的篩選結(jié)果

根據(jù)相關(guān)作用分?jǐn)?shù)及P值<0.05，篩選出與lncRNA44372存在相互作用關(guān)系的基因有579個(gè)。根據(jù)相關(guān)作用分?jǐn)?shù)對(duì)579個(gè)基因進(jìn)行排序，篩選出最具有相關(guān)性的10個(gè)基因(表1)。這些基因的功能主要涉及蛋白激酶活性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等。

表1 相關(guān)性顯著的10個(gè)基因

2.3 與lncRNA44372共表達(dá)基因的GO分析

對(duì)579個(gè)相關(guān)基因和lncRNA44372進(jìn)行GO分析(表2)。結(jié)果顯示，共表達(dá)基因在生物過(guò)程中富集在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架調(diào)控、細(xì)胞遷移、蛋白肽調(diào)節(jié)等方面；分子功能主要富集在信號(hào)傳感器活性的調(diào)節(jié)、MHCⅡ類受體分子的活性、GTP酶激活劑活性、蛋白蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白結(jié)合能力等方面。見(jiàn)圖1。

表2 相關(guān)基因的GO分析

圖1 相關(guān)基因的GO分析

2.4 與lncRNA44372共表達(dá)基因的信號(hào)通路分析

信號(hào)通路富集分析表明，lncRNA44372可以在腫瘤壞死因子受體及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑、p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其受體酪氨酸激酶A介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生、增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移等相關(guān)途徑發(fā)揮作用。

2.5 lncRNA44372的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

生物信息學(xué)在線工具starbase分析發(fā)現(xiàn)lncRNA44372可靶向的miRNA分子有miR-190和miR-193，相關(guān)的下游靶mRNA分子有UBLCP1、PHF20L1、ULK2、MED15、DPY19L1、PYROXD1和LONP2等(圖2 A)。通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶mRNA分子在卵巢癌中的表達(dá)，結(jié)果顯示與正常樣本相比，ULK2分子(t=2.43，P<0.05)和LONP2分子(t=2.49，P<0.05)在卵巢癌中表達(dá)明顯降低(圖2B)。

2.6 lncRNA44372在卵巢癌細(xì)胞的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與卵巢正常HOSEpiC細(xì)胞相比，lncRNA44372在卵巢癌細(xì)胞A2780(t=13.18，P<0.01)，SKOV3(t=12.82，P<0.01)，HO8910(t=5.36，P<0.05)，OVCR3(t=5.19，P<0.05)，3AO(t=4.73，P<0.05)中表達(dá)明顯下調(diào)，且與生物信息學(xué)結(jié)果一致。見(jiàn)圖3。

A:競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建; B: ULK2和LONP2在卵巢癌組織及正常組織中的表達(dá)圖2 競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)及靶mRNA在卵巢癌組織和正常組織中的表達(dá)

a：P<0.05，b: P<0.01，與HOSEpiC細(xì)胞比較圖3 lncRNA44372在卵巢癌細(xì)胞系和卵巢正常細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

本研究首先通過(guò)NCBI GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出在卵巢癌中表達(dá)具有差異意義的lncRNA44372，并進(jìn)一步分析與其相關(guān)的基因。GO分析和信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，lncRNA44372可能與調(diào)控細(xì)胞遷移、侵襲變化，細(xì)胞周期改變，細(xì)胞骨架蛋白調(diào)控，蛋白蘇氨酸/酪氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)等有關(guān)。

研究表明，細(xì)胞遷移和侵襲變化可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程[8]，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移；細(xì)胞周期失控可以使得腫瘤細(xì)胞不接受抑制信號(hào)，持續(xù)增殖[9]；細(xì)胞骨架蛋白R(shí)ho經(jīng)GDP激活后，可以與下游分子結(jié)合使得細(xì)胞骨架重排。有文獻(xiàn)指出，lncRNA PCGEM1可以通過(guò)上調(diào)RhoA表達(dá)促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展[10]。此外，蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶活性對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移具有調(diào)控作用。例如，lncRNA-BANCRY通過(guò)激活蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶，從而通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬來(lái)抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖[11]。但是，lncRNA44372在上述生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮的作用尚需進(jìn)一步研究。

通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，lncRNA44372可能與miR-190，miR-193及下游UBLCP1、PHF20L1、ULK2、MED15、DPY19L1、PYROXD1和LONP2的靶mRNA分子構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)。在該網(wǎng)絡(luò)中，與正常組織相比，lncRNA44372呈低表達(dá)且像海綿體一樣吸附靶miRNA分子，而被吸附的miRNA分子可負(fù)向調(diào)控靶mRNA分子。因此，只有在卵巢癌中下調(diào)表達(dá)的mRNA分子才可能發(fā)揮作用。

研究發(fā)現(xiàn)，ULK2分子在卵巢癌中呈低表達(dá)，其主要作用是編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶，并且可以調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和自噬途徑[12]，該發(fā)現(xiàn)與本研究中GO分析結(jié)果相一致。此外，LONP2分子同樣在卵巢癌中呈低表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，LONP2 在宮頸癌中通過(guò)氧化應(yīng)激促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[13]。因此推斷，lncRNA44372可能與miR-190，miR-193及ULK2和LONP2構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)。此外，在細(xì)胞水平證實(shí)lncRNA44372在卵巢癌中呈低表達(dá)，與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

綜上所述，lncRNA44372在卵巢癌組織中呈低表達(dá)，可能通過(guò)影響卵巢癌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和細(xì)胞蛋白激酶活性等促進(jìn)卵巢癌發(fā)展。