王澤華，聶興華，張 煜，郝雅瓊，李伊然，張 卿， 張鐵強，王廣鵬，秦 嶺，邢 宇*

(1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室，北京 102206； 2.河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹研究所，河北昌黎 066600)

板栗(CastaneamollissimaBl.)是中國重要的經(jīng)濟林樹種之一，已有6 000多年栽培歷史[1]。中國板栗品種豐富，分布范圍廣泛。板栗在生產(chǎn)栽培過程中，會受到栗疫病的危害，影響板栗產(chǎn)量。栗疫病是一種由栗疫病菌引起的真菌性病害[2]，主要危害板栗枝干，其最適生長溫度為25～28 ℃[3]。1904年，在美國紐約動物園的美洲栗上首次發(fā)現(xiàn)栗疫病[4]。在隨后不到半個世紀(jì)的時間內(nèi)該病幾乎摧毀了全境的美洲栗樹[5]。隨后在歐洲意大利、法國等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)栗疫病[6-8]。在中國部分地區(qū)也發(fā)現(xiàn)栗疫病。目前，栗疫病已成為危害栗屬植物的一種全球性病害。

解決栗疫病最有效途徑是選育抗病品種，而篩選抗性強的種質(zhì)資源和解析栗疫病的抗病遺傳機制對抗病育種有重要的指導(dǎo)作用。在栗疫病抗性評價方面，中國板栗一直被認(rèn)為是對栗疫病抗性最強的一個種[9]。中國板栗栗疫病抗性基因是選育抗病品種的重要基礎(chǔ)。秦嶺等[10]從中國北方板栗21個品種(類型)中選出北峪2號、興隆城9號、野生板栗、渤海所18、燕魁和短花栗等7個抗性品種(類型)；HUANG等[11]從中國13個傳統(tǒng)板栗品種中篩選出葉里藏、紅光和晚薄殼3個抗性品種，為生產(chǎn)上選用抗栗疫病品種資源及抗栗疫病親本選擇提供參考。

在栗疫病抗性基因挖掘方面，前人進行大量研究。已有證據(jù)表明中國栗樹對栗疫病的抗性是由2個不連鎖的共顯性基因控制[12]；KUBISIAK等[13]鑒定出與栗疫病相關(guān)的3個抗性區(qū)段，其中2個抗性區(qū)段與桃中的白粉病抗性相關(guān)；通過對美國和中國板栗的轉(zhuǎn)錄組分析比較，已經(jīng)鑒定幾種可能參與栗疫病防御反應(yīng)的基因[14-15]；在歐洲，亞洲和歐洲板栗之間的種間雜交已經(jīng)產(chǎn)生對栗疫病具有一定程度抗性的雜交種[16-17]；同時，XING等[18]發(fā)布中國板栗基因組；JI等[19]構(gòu)建中國板栗高密度遺傳圖譜，為今后中國板栗栗疫病抗性研究提供一定基礎(chǔ)。

為進一步挖掘中國板栗栗疫病抗病數(shù)量性狀位點，本研究選用河北省昌黎果樹研究所栽培的‘燕山早豐’與‘燕晶’及其正反交群體。對該雜交群體175個F1代進行栗疫病接種試驗并對抗病數(shù)量性狀位點進行初定位，鑒定板栗栗疫病抗病數(shù)量性狀位點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料育種

以河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹研究所雜交育種圃栽培的‘燕山早豐’與‘燕晶’及其正反交群體為試材，共選用175個F1代，其中‘燕山早豐’一年生枝條接種栗疫病菌后病斑面積為51 mm2；‘燕晶’一年生枝條接種栗疫病菌后病斑面積72 mm2。試驗材料選擇在田間已栽培7年的成熟板栗樹體，隨機選取3根結(jié)果母枝上長約30 cm、直徑約10 mm的一年生枝條，隨后進行離體抗性評價。

1.2 供試菌株與菌株培養(yǎng)

供試菌株為‘EP155’(CryphonectriaparasiticaEP155)，菌落橘黃色的野生型強毒力菌株，保存于北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院秦嶺課題組(圖1)。

將活化EP155菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，光照16 h/d條件下培養(yǎng)。

1.3 枝條離體接種

采用枝條離體接種[20]。將接種枝條進行酒精消毒后吹干，用長6 mm、寬2 mm的打孔器在枝條上按一定間距打3個孔，要求孔能夠見木質(zhì)部。用直徑6 mm的打孔器挑取在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d的供試菌株，用于離體枝條接種。同時用未接菌的PDA培養(yǎng)基接種枝條，設(shè)置對照。每個子代重復(fù)3次，在接種完成后將枝條平放在鋪有濕潤吸水紙的托盤上，放入溫度28 ℃、濕度60%、光照16 h/d的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

接種后每隔1 d觀測一次枝條發(fā)病情況，測量記錄病斑長度、寬度，觀察病斑擴展速率。調(diào)查持續(xù)4 d。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)病斑長度、寬度計算出枝條發(fā)病面積，對枝條發(fā)病面積進行抗性分級；將雜交群體離體接種枝條的病斑面積用Excel整理，把其改為*qua文件格式保存。結(jié)合秦嶺課題組已發(fā)表的中國板栗高密度遺傳圖譜[19]，以區(qū)間作圖法(Interval Mapping, IM)進行栗疫病抗性相關(guān)基因的數(shù)量性狀位點(quantitative trait loci，QTL)定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交群體抗性分級

栗疫病菌接種雜交群體4 d后，枝條平均潰瘍面積呈連續(xù)變異且頻數(shù)分布符合正態(tài)分布趨勢(圖2)，有利于栗疫病抗性基因QTL分析。根據(jù)接種后離體枝條的潰瘍面積，將雜交群體分為5級。第I級38個子代，平均潰瘍面積33～48 mm2；第II級68個子代，平均潰瘍面積48～63 mm2；第III級42個子代，平均潰瘍面積63～78 mm2；第IV級26個子代，平均潰瘍面積78～93 mm2；第V級1個子代，平均潰瘍面積93～107 mm2；將第I級定為抗病子代、第III級定為中抗子代，第V級定為易感子代(圖3)。

2.2 雜交群體栗疫病抗性QTL定位

根據(jù)雜交群體的栗疫病抗性鑒定結(jié)果，結(jié)合北京農(nóng)學(xué)院秦嶺課題組已發(fā)表的板栗高密度遺傳圖譜[19]，利用區(qū)間作圖法，對抗病QTL的位置和效應(yīng)進行分析(表1和圖4)。共檢測到13個栗疫病抗性QTL，分布在LG1、LG5、LG6、LG7和LG11連鎖群上，單個QTL的貢獻(xiàn)率為6.4%～12.0%。其中，np1010、lm1157和hk52的貢獻(xiàn)率較高，分別為12.0%、8.3%、8.1%，這3個位點可能是板栗栗疫病抗性基因的關(guān)鍵位點。

表1 基于區(qū)間作圖法鑒定的中國板栗栗疫病抗性QTLTab.1 QTL for resistance to chestnut blight by IM mapping

3 討 論

人們對栗疫病的研究集中在病菌的侵染循環(huán)、遺傳結(jié)構(gòu)、毒力分化方面[21]。黃宗安[22]在錐栗栗疫病的研究中發(fā)現(xiàn)，樹皮中多酚類物質(zhì)、黃酮類化合物、木質(zhì)素含量以及多酚氧化酶活性等物質(zhì)與錐栗栗疫病抗性相關(guān)；STATON等[23]篩選到15個可能與栗疫病抗性相關(guān)基因。近年來，植物免疫調(diào)控研究取得一系列研究進展[24-25]。越來越多的抗病機制被發(fā)現(xiàn)，比如激酶通過磷酸化反應(yīng)在生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，目前已報道多種受體激酶或受體蛋白參與植物免疫信號的識別和激活[26]；XING等[18]發(fā)布中國板栗基因組；這些研究進展都將促進栗疫病抗病育種的進程。

利用遺傳連鎖圖譜進行數(shù)量性狀QTL定位在果樹分子育種中有很重要的作用。姚玉新等[27]利用蘋果品種‘東光’和‘富士’的正反交F1群體，獲得與果實酸度基因Ma相連鎖的分子標(biāo)記SDY085；梨樹上，MONTANARI等[28]對‘PEAR3’בMoonglow’F1群體抗枯萎病性狀進行QTL分析，在父本LG2上發(fā)現(xiàn)一個主效QTL位點；YUAN等[29]利用2個寬皮橘雜交的F1群體對柑橘果皮果肉的色差值進行QTL定位得到一些候選區(qū)間。本研究利用‘燕山早豐’與‘燕晶’雜交后代進行栗疫病抗性QTL定位，挖掘與栗疫病抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記，為栗疫病抗病分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定一定理論基礎(chǔ)。本研究選用一年生枝條作抗病評價材料，評價1年的數(shù)據(jù)，這些因素可能會影響抗病QTL定位結(jié)果。

本研究在JI等[19]遺傳圖譜第1連鎖群、第5連鎖群、第6連鎖群、第7連鎖群、第11連鎖群上鑒定到栗疫病抗性QTL位點，通過與已發(fā)表的栗疫病抗性QTL位點進行比較，發(fā)現(xiàn)本研究鑒定到的第6連鎖群與KUBISIAK等[13]定位的Cbr2位點重合。