徐 陽(yáng)，崔麗娥，趙新玉，張兆恒，王 麗，宋亞申，王維香

(北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

玉米(ZeaMaysL.)是全球普遍種植的糧、飼兼用的重要作物[1-2]。玉米莖腐病是一種真菌性玉米病害，嚴(yán)重危害世界各玉米產(chǎn)區(qū)的生產(chǎn)[1]。玉米莖腐病一般在玉米生長(zhǎng)過(guò)程中的乳熟期達(dá)到發(fā)病高峰，而此時(shí)正是玉米形成果穗的關(guān)鍵時(shí)期。玉米莖腐病危害嚴(yán)重，且進(jìn)一步呈上升趨勢(shì)，發(fā)病率一般為15%～20%，嚴(yán)重時(shí)可高達(dá)80%，玉米產(chǎn)量損失最高可達(dá)20%[3-7]。玉米莖腐病病情的逐年加重已成為玉米生產(chǎn)中亟待解決的問(wèn)題并成為限制玉米生產(chǎn)的重要因素之一[8]。發(fā)掘更好的抗性種質(zhì)資源、克隆和鑒定新的抗性基因和深入探究玉米響應(yīng)病原物侵染的分子作用機(jī)理，將會(huì)為種質(zhì)資源創(chuàng)新和培育抗性品種提供理論基礎(chǔ)。

早期研究表明，植物數(shù)量抗性位點(diǎn)(Quantitative Resistance Loci，QRL)對(duì)病原菌表現(xiàn)出部分抗性，這種抗性通常能夠持久保持，對(duì)抗的病原菌種類(lèi)多，且具有廣譜性[9]。近年來(lái)，隨著模式作物序列的公布和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，作物中抗病QTL的克隆取得很大研究進(jìn)展，大量的QTL位點(diǎn)被克隆[10]。涉及到這些QTL位點(diǎn)的抗病基因僅成功克隆6個(gè)：Lr34[11]、Yr36[12]、Pi21[13]、Rcg1[14-15]、ZmWAK[16]和ZmCCT[17]，而且有關(guān)這些QTL位點(diǎn)的抗病基因分子作用機(jī)制缺乏報(bào)道。這些QTL抗病基因中，Pi21基因是一個(gè)對(duì)水稻稻瘟病具有廣譜抗性的QTL，表現(xiàn)出非小種特異的抗性[13]。FUKUOKA等[18]利用近等基因系材料定位并克隆Pi21基因。Pi21編碼一個(gè)富含脯氨酸的蛋白，該蛋白包含一個(gè)重金屬結(jié)合功能域和一個(gè)蛋白與蛋白互作功能域。小麥中，通過(guò)圖位克隆方法獲得的Lr34編碼一個(gè)類(lèi)似ABC transporter的蛋白，對(duì)小麥葉銹病、小麥條銹病和小麥白粉病均有抗性[11,19]?？共』験r36控制著高溫條件下對(duì)小麥條銹病的廣譜抗性[12]。FU等[12]利用感病親本Langdon與遺傳背景相近的重組代換系雜交的分離群體對(duì)Yr36進(jìn)行精細(xì)定位，并在此基礎(chǔ)上克隆Yr36，該基因編碼一個(gè)包含激酶功能域和START磷脂結(jié)合功能域的蛋白，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)π←湕l銹病的抗病性具有重要作用。

鐘濤[20]和TAO等[21]采用連續(xù)精細(xì)定位方法，在玉米重組個(gè)體后代測(cè)定中精細(xì)定位一系列抗病QTL，如：抗粗縮病的qMrdd1、抗絲黑穗病的qHSR1、抗灰斑病的qRgls1和qRgls2，并克隆抗莖腐病和抗絲黑穗病的QTL。左為亮[22]利用重組個(gè)體后代測(cè)定的QTL連續(xù)精細(xì)定位和克隆檢測(cè)到一個(gè)抗絲黑穗病主效QTL，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)鑒定證明該主效抗病QTL為ZmWAK基因。該基因編碼細(xì)胞壁相關(guān)激酶，在圍繞韌皮部的薄壁細(xì)胞中高表達(dá)，能夠激活水楊酸依賴(lài)的抗病響應(yīng)基因，抑制病原菌的生長(zhǎng)，從而達(dá)到最佳的抗病效果。

針對(duì)玉米禾谷鐮刀菌[23]、腫囊腐霉菌[24]、赤霉菌[25]等病原菌莖腐病，已經(jīng)鑒定到一些QTLs，但由于研究采用的手段和群體有所差異，使得QTLs具有不同的遺傳特性[20]。SONG等[24]在抗腐霉莖腐病自交系齊319中定位并克隆抗腫囊腐霉菌莖腐病基因RpiQI319-1和RpiQI319-2。DUAN等[26]在抗病材料X178中將抗腫囊腐霉菌莖腐病顯性基因RpiX178-1精確定位到1號(hào)染色體分子標(biāo)記SSRZ8和IDP2347之間。MA等[25]在抗病自交系H127R材料中將抗赤霉菌莖腐病QTL-qRfg3定位到3號(hào)染色體，物理距離精確到350 kb。

研究報(bào)道，Pè等[23]利用高抗莖腐病玉米自交系B87和高感莖腐病自交系33-16組配150個(gè)F2:3家系。接種禾谷鐮刀菌后對(duì)性狀進(jìn)行鑒定和分析，定位到5個(gè)抗禾谷鐮刀菌莖腐病的QTL位點(diǎn)，分別位于第1號(hào)、第3號(hào)、第4號(hào)、第5號(hào)和第10號(hào)染色體上。JUNG等[27]將玉米抗炭疽莖腐病的主效QTL(Rcg1)定位到第4號(hào)染色體長(zhǎng)臂上。WOLTERS等[15]克隆抗炭疽莖腐病的主效QTL-Rcg1。Rcg1是玉米抗炭疽莖腐病的一個(gè)主效QTL基因。該基因編碼一個(gè)典型的NBS-LRR類(lèi)抗病基因蛋白，這一家族蛋白在病原菌識(shí)別、植物抗病反應(yīng)過(guò)程中起重要作用[28-29]。YANG等[30]認(rèn)為玉米對(duì)腫囊腐霉菌莖腐病的抗性受單基因Rpi1控制，并將其定位在第4號(hào)染色體分子標(biāo)記bnlg1937和agrr286之間，遺傳距離為5.7cM。董五輩和王國(guó)英[31]利用高抗莖腐病自交系P138和高感莖腐病自交系5003組配F2:3家系，通過(guò)接種腫囊腐霉菌鑒定表型，同時(shí)檢測(cè)基因型，將抗病基因定位在第4號(hào)染色體分子標(biāo)記bnlg490和umc1382之間，遺傳距離為4.1cM。

前期研究中，YANG等[30]將一個(gè)抗禾谷鐮刀菌莖腐病的單基因定位在第6號(hào)染色體分子標(biāo)記mmc0241和bnl3.03之間，遺傳距離為5.0cM，他們將另一個(gè)抗禾谷鐮刀菌莖腐病主效QTL-qRfg1定位到bin10.04染色體500 kb區(qū)段內(nèi)，可使抗性提高37.2%～54.4%[9,15,20]。他們將主效QTL-qRfg1位置縮短到170 kb范圍內(nèi)，通過(guò)高密度遺傳圖譜分析和轉(zhuǎn)基因植物抗性鑒定等手段克隆到玉米抗莖腐病數(shù)量抗病基因ZmCCT。在ZmCCT轉(zhuǎn)基因T2代、T4代和T6代中，陽(yáng)性植株田間抗性平均提高30%，具有明顯的抗莖腐病功能。他們利用以1145和Y331構(gòu)建的回交群體(Y331為輪回親本)，對(duì)位于2號(hào)染色體上bin10.04位置的主效QTL-qRfg1進(jìn)行精細(xì)定位。利用4 035株BC6F1群體(來(lái)自41個(gè)BC5F1交換單株)將qRfg1定位到約190 kb的區(qū)間內(nèi)。此后，利用新開(kāi)發(fā)的標(biāo)記CCT11和SSR483在4 035株BC6F1群體中進(jìn)一步篩選重組個(gè)體，找到位于定位區(qū)段內(nèi)的2個(gè)新的重組類(lèi)型，將qRfg1區(qū)段縮小到分子標(biāo)記CCT11和SNP551之間，物理距離約為170 kb。通過(guò)多分子標(biāo)記篩選BAC文庫(kù)，通過(guò)測(cè)序，序列比較和功能注釋?zhuān)_定ZmCCT為QTL-qRfg1的候選基因，并克隆到抗禾谷鐮刀菌莖腐病基因ZmCCT[32]。

目前，有關(guān)玉米抗莖腐病基因ZmCCT的抗病作用機(jī)理尚不明確。已知ZmCCT基因編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，定位于細(xì)胞核并含有保守的CCT功能域[9]。ZmCCT中含有的CCT保守域在玉米抗莖腐病過(guò)程中起重要作用。CCT結(jié)構(gòu)域?yàn)橹参锼赜?，CCT家族的基因是參與植物抗逆過(guò)程的重要基因。CCT結(jié)構(gòu)域最早在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)，其C端是由約43～45個(gè)氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域，該段氨基酸序列在CONSTANS，CONSTANS類(lèi)基因和TIMING OF CAB1(TOC1)表現(xiàn)為高度保守，因此，它被命名為CCT結(jié)構(gòu)域[33-35]。ZmCCT作為一個(gè)典型的CCT結(jié)構(gòu)域因子，究竟如何響應(yīng)抗病逆境信號(hào)，如何在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控下游靶標(biāo)基因來(lái)實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能尚不清楚。進(jìn)一步鑒定CCT保守結(jié)構(gòu)域的功能，探究ZmCCT基因編碼產(chǎn)物參與抗病的分子機(jī)理，有助于全面解析ZmCCT基因的作用機(jī)制。本研究將進(jìn)一步探究抗玉米莖腐病基因ZmCCT的功能，對(duì)ZmCCT基因的缺失區(qū)段進(jìn)行載體構(gòu)建及原核蛋白表達(dá)并在大腸桿菌中表達(dá)純化，為后續(xù)ZmCCT蛋白免疫抗體的制備和分子機(jī)理等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

玉米近等基因系Y331-△TE1是攜帶不含轉(zhuǎn)座子的抗病ZmCCT等位基因，玉米近等基因系Y331是攜帶含轉(zhuǎn)座子的感病ZmCCT等位基因，見(jiàn)圖1(Y331-△TE1和Y331來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)徐明良教授)。溫室培養(yǎng)(28 ℃，光照16 h；24 ℃，黑暗8 h)，待生長(zhǎng)到三葉一心時(shí)采集植株地上部分，并將樣品液氮速凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

pMD19-T載體和Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限責(zé)任公司。PGEX-6P-1載體為北京農(nóng)學(xué)院作物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)和質(zhì)粒小提試劑盒(DP103)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。Prime Seript One-Step gDNA Removal、cDNA Synthesis SuperMix試劑盒、6×DNA loading buffer(G2525)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)溶液(I5005)和LAB2000 DNA Marker(L2000)均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1ZmCCT基因不同缺失區(qū)段的擴(kuò)增與原核表達(dá)載體的構(gòu)建 使用Trizol法提取玉米Y331-ΔTE1組織的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄，獲得第一鏈cDNA，保存于-20 ℃，備用。

ZmCCT全長(zhǎng)的正向引物為5′-TTGGATCCATGATGTCGTCGGGGCCAGCAGC-3′，反向引物為5′-TTCTCGAGTCATTCGGTTACCTTGGCAA-3′。根據(jù)NCBI網(wǎng)站GenBank上ZmCCT基因的序列(LOC103641424，圖2)，使用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)4對(duì)克隆引物。4對(duì)克隆引物分別為ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540(表1)。以cDNA為模板分別用4對(duì)克隆引物進(jìn)行擴(kuò)增。

表1 引物序列Tab.1 DNA sequence for primer

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。膠回收試劑盒回收目的片段?；厥盏腄NA產(chǎn)物存放于-20 ℃，備用。

將回收DNA產(chǎn)物與pMD19-T(simple)載體進(jìn)行連接。復(fù)蘇感受態(tài)細(xì)胞BMTOP10加入T載體反應(yīng)連接液，震蕩培養(yǎng)1 h。將菌液接種到含氨芐西林抗性的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)12～14 h。使用高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒(柱離心型)進(jìn)行質(zhì)粒提取，得到含有目的片段的質(zhì)粒DNA。用限制性?xún)?nèi)切酶(BamHI、XhoI)對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性DNA片段亞克隆到原核表達(dá)載體PGEX-6P-1中，16 ℃過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。然后挑取單菌落并將其接種于LB液體培養(yǎng)基中(含100 g/mL的氨芐西林)過(guò)夜培養(yǎng)，菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.2ZmCCT缺失區(qū)段原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定 將鑒定為克隆陽(yáng)性的PGEX-6P-1-ZmCCT1-300、PGEX-6P-1-ZmCCT300-540、PGEX-6P-1-ZmCCT1-540和PGEX-6P-1-ZmCCT540-717質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Rosetta中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單株菌落。再接種于LB液體培養(yǎng)基(100 μg/mL的氨芐西林)中，過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接到3 mL LB液體培養(yǎng)基(100 μg/mL的氨芐西林)中，37 ℃振蕩培養(yǎng)約1 h。菌液OD600值為0.6時(shí)，加入0.4 mmol/L的IPTG，16 ℃培養(yǎng)誘導(dǎo)3 h，離心，棄上清，收集沉淀，沉淀使用1×PBS重懸，并加入1×loading buffer，100 ℃金屬浴加熱12 min，使蛋白變性。經(jīng)高溫變性后的樣品4 ℃、12 000 r/min離心3 min。將誘導(dǎo)菌株P(guān)GEX-6P-1-ZmCCT和未誘導(dǎo)的陰性對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，對(duì)重組菌表達(dá)及可溶性情況進(jìn)行初步鑒定。

分別挑選2個(gè)生長(zhǎng)較好的單株菌落，接種至2 mL LB液體培養(yǎng)基(100 μg/mL的氨芐西林)中，于搖床(37 ℃，220 r/min)中培養(yǎng)12～14 h；將400 μL培養(yǎng)液接種于帶有氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)(每組2管)，搖床37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.6。選取一組加入6 μL終濃度為0.4 mmol/L誘導(dǎo)劑IPTG。另一組不加誘導(dǎo)劑IPTG作為陰性對(duì)照，搖床37 ℃，220 r/min培養(yǎng)3 h。將1.5 mL培養(yǎng)液加入離心管內(nèi)，12 000 r/min離心3 min收集沉淀；在1.5 mL培養(yǎng)液的沉淀中加入15 μL的10×loading buffer和20 μL的ddH2O混勻，100 ℃變性處理使其充分混合，重懸后取8 μL重懸液上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳(120 V恒壓，1.5 h)；使用考馬斯亮藍(lán)染色1 h，脫色后鑒定。

1.2.3 PGEX-6P-1-ZmCCT表達(dá)產(chǎn)物的純化 在0.01～5.00 mmol/L的范圍內(nèi)改變誘導(dǎo)劑IPTG濃度，在誘導(dǎo)的不同時(shí)間測(cè)定OD600值。依據(jù)SDS-PAGE分析，確定終濃度為0.4 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，過(guò)夜培養(yǎng)8 h為最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。吸取12～14 mL菌液至1 000 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600值為0.6。加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，過(guò)夜培養(yǎng)8 h。離心，收集沉淀，加入裂解緩沖液充分懸浮菌體沉淀。超聲處理破碎細(xì)胞后離心(4 ℃ 12 000 r/min，15 min)，取上清，并吸取1 mL作為對(duì)照。用裂解緩沖液平衡鎳柱約30 mL，加入40 μL載體標(biāo)簽對(duì)應(yīng)的親和層析珠，充分結(jié)合4 h。洗脫收集蛋白純化液體，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，觀察純化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540 片段的構(gòu)建

ZmCCT中約582～714 bp位置含有一個(gè)保守CCT結(jié)構(gòu)域。將ZmCCT基因分為3個(gè)缺失區(qū)段，然后構(gòu)建4個(gè)缺失突變體ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT1-540和ZmCCT540-717，見(jiàn)圖3。

2.2 ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540 缺失區(qū)段PCR產(chǎn)物片段的獲得

PCR擴(kuò)增得到ZmCCT基因的缺失區(qū)段。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，ZmCCT1-300、ZmCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540分別在約300、240、177和540 bp處呈現(xiàn)特異性條帶，且與預(yù)期的條帶大小吻合，見(jiàn)圖4。

2.3 pMD19-T載體重組質(zhì)粒的鑒定

將ZmCCT片段插入pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞TOP10中，過(guò)夜培養(yǎng)單克隆菌落并提取重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定后進(jìn)行凝膠電泳分析，在預(yù)期位置出現(xiàn)大小合適的目的片段(圖5，圖中雜帶為引物非特異性擴(kuò)增)，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化回收。

2.4 PGEX-6P-1載體重組質(zhì)粒的雙酶切與測(cè)序鑒定

連接pMD19-T載體回收后的片段插入到PGEX-6P-1表達(dá)載體后，經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定，在預(yù)期位置出現(xiàn)大小合適的DNA目的條帶(圖6，圖中雜帶為引物非特異性擴(kuò)增)。同時(shí)，將條帶正確的克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)DNA序列完全正確，未出現(xiàn)點(diǎn)突變。

2.5 ZmCCT 基因在原核表達(dá)載體中的表達(dá)及可溶性分析

將PGEX-6P-1-ZmCCT重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)宿主菌，挑取菌落進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)小量檢測(cè)，當(dāng)加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，ZmCCT1-300、ZmCCT300-540、ZmCCT540-717和ZmCCT1-540均有明顯蛋白富集，而未誘導(dǎo)宿主菌未見(jiàn)明顯表達(dá)(圖7)。將已經(jīng)表達(dá)的菌液按照菌液∶甘油=3∶2的比例保存于-80 ℃，用于蛋白純化。

2.6 ZmCCT 基因表達(dá)蛋白的純化

親和層析純化重組蛋白，將超聲前的上清、不同批次的洗脫液、結(jié)合后的流穿液分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。流經(jīng)鎳柱后，重組蛋白均結(jié)合到表達(dá)載體對(duì)應(yīng)標(biāo)簽的親和層析珠上，洗脫后獲得大小相符的目的條帶，盡管有雜帶出現(xiàn)，但在對(duì)應(yīng)大小處有大量蛋白富集。成功獲得ZmCCT1-300、ZmCCT300-540和ZmCCT1-540三段表達(dá)符合預(yù)期的蛋白(圖8)。

3 討 論

玉米莖腐病發(fā)病常導(dǎo)致玉米莖稈變黃直至枯萎，是嚴(yán)重危害玉米生產(chǎn)的土傳真菌病害。近年來(lái)，隨著模式作物序列的公布和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，盡管作物中抗病QTL的克隆取得很大進(jìn)展，但是，由于植物數(shù)量抗病基因的復(fù)雜性，迄今為止，僅有為數(shù)不多的QTL抗病基因被克隆到。ZmCCT基因作為目前僅有的抗禾谷鐮刀菌莖腐病基因被克隆，WANG等[32]和KU等[33]研究ZmCCT基因一個(gè)近130 kb的QTL序列區(qū)段上編碼一個(gè)假基因、一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子和兩個(gè)轉(zhuǎn)座因子，轉(zhuǎn)座子TE1的插入導(dǎo)致ZmCCT功能發(fā)生變化，當(dāng)TE1插入時(shí)，玉米抗禾谷鐮刀菌的抗性減弱。

CCT結(jié)構(gòu)域?yàn)橹参锼赜?，在編碼開(kāi)花相關(guān)基因的蛋白中被發(fā)現(xiàn)，是典型的一因多效基因，參與植物調(diào)控光周期開(kāi)花、光信號(hào)傳導(dǎo)、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)和植物生長(zhǎng)等過(guò)程[34]。CONSTANS蛋白中包含兩個(gè)高度相似的B-Box結(jié)構(gòu)域，B-Box結(jié)構(gòu)域中有7個(gè)保守的殘基使得CCT結(jié)構(gòu)域高度保守[35]。在本研究中，ZmCCT1-300、ZmCCT300-540和ZmCCT1-540三個(gè)缺失區(qū)段在對(duì)應(yīng)蛋白大小處出現(xiàn)明顯的條帶，經(jīng)鎳柱純化后，獲得高純度的重組融合蛋白。CCT結(jié)構(gòu)域大約位于ZmCCT基因的580 bp到714 bp的位置上，雖然成功構(gòu)建僅包含CCT結(jié)構(gòu)域的蛋白表達(dá)載體，但是未成功純化出原核蛋白?？赡苁怯捎贑CT的特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的，CCT結(jié)構(gòu)域編碼的蛋白屬于鋅指蛋白超家族，鋅指蛋白的三維結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，這可能是ZmCCT540-717未成功純化的原因之一[27]。還有可能是ZmCCT540-717沒(méi)有進(jìn)行原核蛋白表達(dá)，后期準(zhǔn)備嘗試用真核表達(dá)載體進(jìn)行純化ZmCCT540-717區(qū)段蛋白。

此外，ZmCCT不僅在抗玉米禾谷鐮刀菌抗性中起到非常重要的作用，同時(shí)還受到光周期的調(diào)節(jié)從而影響玉米的花期[18]。ZmCCT所在的位置是許多重要農(nóng)藝性狀QTL定位的熱點(diǎn)位置，可能是其他逆境脅迫響應(yīng)的熱點(diǎn)。ZmCCT啟動(dòng)子中TE1轉(zhuǎn)座子也是降低光周期敏感性的突變位點(diǎn)。ZmCCT究竟如何參與逆境脅迫的信號(hào)響應(yīng)？以及ZmCCT如何作為轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同其他互作蛋白去調(diào)控下游的靶標(biāo)基因？這些問(wèn)題有待于進(jìn)一步研究。該研究為進(jìn)一步探究ZmCCT的功能，后續(xù)免疫蛋白抗體的制備以及下游靶標(biāo)基因的尋找等分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。