劉磊 張景曉 狄曉萌 謝竹霄 王佳偉

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是最嚴(yán)重的感染性疾病之一，具有病程進(jìn)展迅速、病死率高等特點(diǎn)，主要包括感染性腦炎、腦膜炎、腦膜腦炎和脊髓炎，表現(xiàn)為精神行為異常、癲發(fā)作、頭痛、發(fā)熱、局灶性神經(jīng)功能缺損，常見病原微生物為細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等，若不及時(shí)對病原體進(jìn)行針對性治療，病情迅速加重，可出現(xiàn)癲持續(xù)狀態(tài)、昏迷，甚至危及生命［1］。臨床鑒別診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染與自身免疫性腦炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎、原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腦腫瘤、代謝中毒性疾病困難，故病原學(xué)診斷至關(guān)重要。組織活檢病理仍是確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但侵入性外科手術(shù)導(dǎo)致的并發(fā)癥使得組織活檢術(shù)的臨床實(shí)際比例極低，故在缺乏病理學(xué)檢查情況下，其診斷依賴腦脊液病原微生物的分離與培養(yǎng)［2］，但陽性率較低、耗時(shí)較長且存在一定比例的漏診和誤診，無法為臨床及時(shí)提供診斷與治療信息［3］，迫切需要一種快速、敏感、可靠的病原學(xué)診斷方法。近年來，以不針對特定病原微生物和高通量為特點(diǎn)的病原宏基因組第二代測序技術(shù)（mNGS）因檢測速度快、覆蓋病原微生物范圍廣、可為臨床不典型病例提供診斷依據(jù)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于感染性疾病的診斷［4］。一方面，腦脊液病原mNGS測序在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中的診斷價(jià)值已獲得越來越多的驗(yàn)證［5-8］；另一方面，臨床有過分依賴mNGS測序和盲目送檢腦脊液標(biāo)本的趨勢，造成不必要的浪費(fèi)。鑒于此，我院對35例需排除中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的腦脊液病原mNGS測序、傳統(tǒng)病原學(xué)檢測與臨床最終診斷進(jìn)行對比分析，再根據(jù)7條基于臨床和常規(guī)輔助檢查結(jié)果制定的腦脊液病原mNGS測序送檢標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，探討提高mNGS測序陽性符合率的腦脊液送檢標(biāo)準(zhǔn)。

資料與方法

一、臨床資料

1.納入標(biāo)準(zhǔn)（1）本研究送檢腦脊液病原mNGS測序參照2013年國際腦炎聯(lián)盟（IEC）共識(shí)［9］，符合以下1項(xiàng)及以上標(biāo)準(zhǔn)：①精神狀態(tài)改變（定義為意識(shí)水平下降或改變、嗜睡或人格改變）持續(xù)時(shí)間≥24 h。②癲發(fā)作，除外既往癲或者單純熱性驚厥。③發(fā)病前或發(fā)病后72 h內(nèi)記錄到體溫≥38℃。④出現(xiàn)新的局灶性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。⑤腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥5/mm3。⑥影像學(xué)顯示的腦實(shí)質(zhì)新發(fā)病灶提示腦炎。⑦腦電圖異常提示腦炎。（2）即使不符合上述7項(xiàng)送檢標(biāo)準(zhǔn)中任意一項(xiàng)，根據(jù)臨床需要仍需送檢腦脊液病原mNGS測序的患者。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)（1）自身免疫性腦炎和神經(jīng)系統(tǒng)副腫瘤綜合征。（2）風(fēng)濕免疫性疾?。òㄏ到y(tǒng)性紅斑狼瘡、Behcet綜合征、血管炎等）繼發(fā)累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。（3）神經(jīng)梅毒和獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）。（4）臨床資料不完整。

3.一般資料選擇2017年3月至2020年4月由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科送檢的腦脊液標(biāo)本共35份，其中，男性24例，女性11例；年齡19～79歲，中位年齡52歲。

二、研究方法

1.腦脊液病原mNGS測序（1）檢測方法：所有患者均于入院48 h內(nèi)完成首次腰椎穿刺抽取腦脊液2 ml，送檢深圳華大基因研究院、予果生物科技（北京）有限公司和北京金匙基因科技有限公司之一，行腦脊液病原mNGS測序。為減少不同公司檢測技術(shù)對結(jié)果的影響，通過數(shù)據(jù)量進(jìn)行序列數(shù)的均一化處理：mNGS測序數(shù)據(jù)量為（15～20）×106條序列/樣本，根據(jù)每例樣本的實(shí)際總數(shù)據(jù)量將每個(gè)病原微生物的序列數(shù)進(jìn)行均一化處理，計(jì)算公式為x條唯一比對序列數(shù)/百萬條序列數(shù)，再與臨床數(shù)據(jù)和信息對比分析。（2）檢出病原微生物的致病性判斷：①結(jié)合已發(fā)表文獻(xiàn)與本組患者臨床表現(xiàn)的一致性判斷。②結(jié)合傳統(tǒng)腦脊液病原學(xué)檢測結(jié)果相互驗(yàn)證。③結(jié)合臨床用藥后癥狀改變和預(yù)后關(guān)聯(lián)分析。

2.傳統(tǒng)病原學(xué)檢測所有患者均于入院48 h內(nèi)完成首次腰椎穿刺抽取腦脊液8～10 ml，行傳統(tǒng)病原學(xué)檢測，包括病原微生物培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、病原體抗體測定等。必要時(shí)完善血漿真菌1-3-β-D葡聚糖動(dòng)態(tài)定量檢測（G試驗(yàn)）/半乳甘露聚糖檢測（GM試驗(yàn)）和血清病原體抗體測定。

3.中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染臨床擬診標(biāo)準(zhǔn)參照2013年國際腦炎聯(lián)盟共識(shí)［9］，臨床擬診腦炎應(yīng)滿足以下條件：（1）主要標(biāo)準(zhǔn)，精神狀態(tài)改變（定義為意識(shí)水平下降或改變、嗜睡或人格改變）持續(xù)時(shí)間≥24 h，除外其他原因；癲發(fā)作，除外既往癲或單純熱性驚厥。（2）次要標(biāo)準(zhǔn)，符合以下2項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)診斷為腦炎可能，符合≥3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)診斷為腦炎可能性大。①發(fā)病前或者發(fā)病后72 h內(nèi)記錄到體溫≥38℃。②出現(xiàn)新的局灶性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。③腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥5/mm3。④影像學(xué)顯示的腦實(shí)質(zhì)新發(fā)病灶提示腦炎。⑤腦電圖異常提示腦炎。參照歐洲各國［歐洲神經(jīng)科學(xué)協(xié)會(huì)聯(lián)盟（EFNS）、荷蘭和英國］腦膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［10-12］，臨床擬診為腦膜炎應(yīng)符合以下≥2項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，（1）頭痛。（2）發(fā)熱（發(fā)病前或發(fā)病后72 h內(nèi)記錄到體溫≥38℃）。（3）頸項(xiàng)強(qiáng)直。（4）意識(shí)水平下降［Glasgow昏迷量表（GCS）評(píng)分＜14］，且腰椎穿刺腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥5/mm3。

4.臨床最終診斷為出院診斷或死亡診斷，結(jié)合臨床擬診、腦脊液病原mNGS測序、傳統(tǒng)病原學(xué)檢測和輔助檢查（包括腰椎穿刺腦脊液常規(guī)檢測、頭部影像學(xué)檢查和腦電圖檢查等）結(jié)果綜合判斷。

5.統(tǒng)計(jì)分析方法本研究所有數(shù)據(jù)均采用R version3.5.3軟件進(jìn)行處理與分析。計(jì)數(shù)資料以相對數(shù)構(gòu)成比（%）或率（%）表示，采用Fisher確切概率法。以臨床最終診斷為參照，分別計(jì)算腦脊液病原mNGS測序和傳統(tǒng)病原學(xué)檢測的靈敏度和特異度、假陽性率和假陰性率、準(zhǔn)確度、Youden指數(shù)；繪制受試者工作特征（ROC）曲線并計(jì)算曲線下面積（AUC），采用Delong檢驗(yàn)比較腦脊液病原mNGS測序與傳統(tǒng)腦脊液病原學(xué)檢測的診斷效能。根據(jù)送檢腦脊液病原mNGS測序的客觀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分（滿足1條計(jì)1分），計(jì)算不同評(píng)分下mNGS測序的陽性符合率。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

本組35例患者中19例臨床最終診斷為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，詳見表1。其中精神狀態(tài)改變＞24 h者13例（13/19），主要表現(xiàn)為嗜睡、意識(shí)障礙、性格改變等；伴癲發(fā)作4例（4/19）；發(fā)病前或發(fā)病后72 h內(nèi)記錄到體溫≥38℃者12例（12/19）；出現(xiàn)新的局灶性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀16例（16/19）；MRI顯示顱內(nèi)病灶為14例（14/19），僅累及腦干1例、額葉2例、枕葉2例、顳葉1例，以及多發(fā)病灶（同時(shí)累及多個(gè)腦葉、丘腦、基底節(jié)區(qū)、小腦、腦膜等）8例；腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥5/mm3者14例（14/19）；14例完善腦電圖檢查，異常10例（10/14）。16例患者不符合中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的診斷，分別為海綿竇非特異性炎癥4例、視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病3例、特發(fā)性視神經(jīng)炎3例、多發(fā)性硬化1例、其他5例。

表1 19例臨床最終診斷為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的臨床資料Table 1.Clinical information of 19 patients clinically final diagnosed as central nervous system infection

本組有18例腦脊液病原mNGS測序呈陽性，總陽性率為51.43%（18/35）。臨床最終診斷為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者中17例mNGS測序呈陽性，其診斷靈敏度為17/19、特異度為15/16，Youden指數(shù)為0.832，準(zhǔn)確度為91.43%（表2）。其中，有8例病原體為細(xì)菌，分別為單核細(xì)胞增生李斯特菌3例、鏈球菌2例、鼻疽諾卡菌1例、肺炎克雷伯菌1例、新型隱球菌1例；有7例患者病原體為病毒，其分別為人類皰疹病毒1型（HSV-1）3例，HSV-3、HSV-4和HSV-5各1例，偽狂犬病毒1型1例；1例病原體為真菌（煙曲霉菌）；余1例病原體為寄生蟲（囊蟲）。非中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者中1例mNGS測序呈陽性，其診斷假陽性率為1/16、假陰性率為2/19（表2），mNGS測序檢出代爾夫特食酸菌、HSV-1和HSV-4、人類腺病毒B1型、近平滑假絲酵母菌、漢氏德巴利氏酵母、擴(kuò)展青霉菌、煙曲霉菌、人隱孢子蟲，但傳統(tǒng)腦脊液病原檢測均呈陰性，臨床表現(xiàn)為雙眼視力下降和眼動(dòng)受限，輔助檢查結(jié)果亦未提示感染，最終診斷為多組腦神經(jīng)麻痹，予以甲潑尼龍治療后腦神經(jīng)麻痹癥狀好轉(zhuǎn)并痊愈，進(jìn)一步證實(shí)mNGS測序結(jié)果為假陽性結(jié)果。

本組有17例傳統(tǒng)病原學(xué)檢測（包括腦脊液病原微生物培養(yǎng)和PCR反應(yīng)、血漿G試驗(yàn)/GM試驗(yàn)、腦脊液和血清病原體抗體測定）呈陽性，總陽性率約48.57%（17/35）。臨床最終診斷為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者中14例傳統(tǒng)病原學(xué)檢測呈陽性，其診斷靈敏度為14/19、特異度為13/16，Youden指數(shù)為0.612，準(zhǔn)確度為77.14%（表2）。其中，7例病原體為細(xì)菌，分別為鏈球菌2例、鼻疽諾卡菌1例、布魯桿菌1例、肺炎克雷伯菌1例、新型隱球菌1例、單核細(xì)胞增生李斯特菌1例；有5例病原體為病毒，分別為HSV-1 2例，HSV-2、HSV-4和HSV-5各1例；1例病原體 為真菌（煙曲霉菌）；1例病原體為寄生蟲（囊蟲）。非中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者中3例傳統(tǒng)病原學(xué)檢測呈陽性，其診斷假陽性率為3/16、假陰性率為5/19（表2）。

表2 腦脊液病原mNGS測序、傳統(tǒng)病原學(xué)檢測與臨床最終診斷的比較（例）Table 2. Comparison of CSF pathogen mNGS,conventional pathogen test and clinical final diagnosis(case)

進(jìn)一步繪制ROC曲線，腦脊液病原mNGS測序的曲線下面 積 為0.916（95%CI：0.822～1.000，P=0.000）；傳統(tǒng)病原學(xué)檢測的曲線下面積為0.806（95%CI：0.674～0.938，P=0.000）（圖1）；二者診斷效能差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.245，P=0.213）。

圖1 ROC曲線顯示，腦脊液病原mNGS測序的曲線下面積為0.916（95%CI：0.822～1.000，P=0.000），Youden指數(shù)為0.832；傳統(tǒng)病原學(xué)檢測的曲線下面積為0.806（95%CI：0.674～0.938，P=0.000），Youden指數(shù)為0.612Figure 1 ROC curve showed the AUC of CSF pathogen mNGS was 0.916(95%CI:0.822-1.000,P=0.000)with Youden index 0.832,while the AUC of conventional pathogen testing was 0.806(95%CI:0.674-0.938,P=0.000)with Youden index 0.612.

本研究35例患者根據(jù)送檢腦脊液病原mNGS測序的客觀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，其中，0為4例，1為2例，2為8例，3為4例，4為6例，5為4例，6為7例；17例經(jīng)腦脊液病原mNGS測序陽性證實(shí)診斷的患者，2為1例，3為3例，4為4例，5為3例，6為6例。計(jì)算 不同評(píng)分下mNGS測序陽性符合率并繪制曲線，可見隨著評(píng)分的增加，mNGS測序陽性符合率呈升高趨勢（圖2），其中評(píng)分≥3組mNGS測序陽性符合率高于評(píng)分＜3組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（16/21對1/14；Fisher確切概率法：P=0.000）。

圖2 隨著送檢腦脊液病原mNGS測序客觀標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分的增加，mNGS測序陽性符合率呈升高趨勢Figure 2 Positive coincidence rate of mNGS showed an overall trend of increase with higher score of objective inclusion criteria for sending pathogen mNGS of CSF.

討 論

mNGS測序可以對病原微生物進(jìn)行高通量篩查以發(fā)現(xiàn)未知感染，對疾病診斷與治療方案的制定具有重要意義，且相較于傳統(tǒng)病原學(xué)檢測，可以更快獲得檢測結(jié)果，為患者獲得更良好預(yù)后爭取機(jī)會(huì)。mNGS測序作為感染性疾病的診斷方法，可高敏感性 檢 出多部位感 染，包 括神經(jīng)系統(tǒng)［1，13-14］、血 液［15］、呼吸道［16］、胃腸道［17］、泌尿系統(tǒng)［18］和眼部［19］等，還可以對細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲等各類廣泛病原體進(jìn)行篩查［20］，該項(xiàng)技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病中也發(fā)揮重要作用。既往不乏腦脊液病原mNGS測序明確診斷罕見或臨床癥狀不典型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的報(bào)道，如偽狂犬病毒致腦炎［21］、人類細(xì)小病毒B19相關(guān)病毒性腦炎［22］、中間型鏈球菌致腦膿腫［23］、廣州管圓線蟲致腦炎［24］等。

腦脊液病原mNGS測序的高敏感性和特異性業(yè)已得到廣泛證實(shí)。Xing等［25］的前瞻性研究評(píng)價(jià)腦脊液病原mNGS測序在腦炎和腦膜炎中的診斷效能，并首次根據(jù)其檢出的序列數(shù)繪制ROC曲線再計(jì)算各序列數(shù)的曲線下面積以確定mNGS測序的陽性閾值，結(jié)果顯示，腦脊液病原mNGS測序可以有效識(shí)別中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體，檢出序列數(shù)≥5或10時(shí)，細(xì)菌性腦膜炎的診斷效能最佳（曲線下面積為0.846，95%CI：0.711～0.981）；檢出序列數(shù)≥2時(shí)，隱球菌性腦膜炎和腦曲霉病的靈敏度分別為76.92%和80%。Yan等［8］對結(jié)核性腦膜炎患者同時(shí)行腦脊液抗酸桿菌培養(yǎng)、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）、結(jié)核分枝桿菌及利福平快速耐藥檢測（Xpert MTB/RIF）、mNGS測序，以臨床最終診斷為參照，腦脊液病原mNGS測序的診斷靈敏度（84.4%）高于抗酸桿菌培養(yǎng)（0，P=0.000）、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)（22.2%，P=0.000）、實(shí)時(shí)FQ-PCR反應(yīng)（24.4%，P=0.000）和Xpert MTB/RIF檢測（40%，P=0.000）；進(jìn)一步繪制ROC曲線，發(fā)現(xiàn)腦脊液蛋白定量和白細(xì)胞計(jì)數(shù)與mNGS測序陽性率呈正相關(guān)關(guān)系，即蛋白定量越高、白細(xì)胞計(jì)數(shù)越高，mNGS陽性檢出率越高。Zhang等［6］的研究納入疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者，對比分析腦脊液病原mNGS測序與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測（包括腦脊液常規(guī)和生化，細(xì)菌、真菌和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和涂片，自身免疫抗體和乳膠凝集試驗(yàn)，以及血清病原體抗體測定，組織活檢術(shù)，核酸擴(kuò)增試驗(yàn)等）的診斷效能，發(fā)現(xiàn)mNGS測序在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中表現(xiàn)出令人滿意的診斷效能，其陽性檢出率高于傳統(tǒng)病原學(xué)檢測。本研究腦脊液病原mNGS測序?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)感染的診斷靈敏度為17/19、特異度15/16，假陽性率為1/16、假陰性率2/19，準(zhǔn)確度為91.43%，與既往文獻(xiàn)報(bào)道的該項(xiàng)技術(shù)特異性高于敏感性相符［25］。進(jìn)一步繪制ROC曲線，腦脊液病原mNGS測序的曲線下面積為0.916、傳統(tǒng)病原學(xué)檢測為0.806，盡管二者診斷效能差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但值得指出的是，mNGS測序較細(xì)菌培養(yǎng)等傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法節(jié)約了大量時(shí)間。

近年來，mNGS測序技術(shù)迅速發(fā)展，已成為感染性疾病的重要診斷方法，高通量特點(diǎn)使其具有獨(dú)特優(yōu)勢，但局限性也同樣來自高通量，深度測序檢出的微生物可能來自無致病性的正常菌群，目前對此類背景微生物的界定暫無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，測序結(jié)果的判讀尚待進(jìn)一步規(guī)范統(tǒng)一；此外，疾病早期藥物治療也可能影響結(jié)果判讀，因此，mNGS測序技術(shù)的應(yīng)用應(yīng)緊密結(jié)合臨床實(shí)際。

本研究還分析mNGS測序陽性符合率與送檢腦脊液病原mNGS測序客觀標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分的關(guān)系，結(jié)果顯示，隨著評(píng)分的增加，mNGS測序陽性符合率總體呈升高趨勢。本組19例臨床最終診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者中僅2例mNGS測序結(jié)果未能提示感染來源，評(píng)分分別為2和3；再以評(píng)分3為分界點(diǎn)，評(píng)分≥3組mNGS測序陽性符合率高于評(píng)分＜3組?；谏鲜鼋Y(jié)果，筆者研究團(tuán)隊(duì)提出了腦脊液病原mNGS測序的送檢標(biāo)準(zhǔn)為：（1）精神狀態(tài)改變（定義為意識(shí)水平下降或改變、嗜睡或人格改變）的持續(xù)時(shí)間≥24小時(shí)。（2）癲發(fā)作，除外既往癲或者單純熱性驚厥。（3）發(fā)病前或發(fā)病后72小時(shí)內(nèi)記錄到體溫≥38℃。（4）出現(xiàn)新的局灶性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。（5）腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥5/mm3。（6）影像學(xué)顯示的腦實(shí)質(zhì)新發(fā)病灶提示腦炎。（7）腦電圖異常提示腦炎。每項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)賦值為1，評(píng)分≥3可考慮行腦脊液病原mNGS測序。送檢前應(yīng)盡可能排除其他疾病，主要是自身免疫性腦炎。

本研究還出現(xiàn)評(píng)分為3患者mNGS測序陽性符合率高于評(píng)分為4患者（3/4對4/6）的反?，F(xiàn)象，考慮可能是由于本研究數(shù)據(jù)來自單中心且樣本量相對較小所致；此外，盡管本研究的納入標(biāo)準(zhǔn)主要參照2013年國際腦炎聯(lián)盟共識(shí)［9］，但未參照該共識(shí)采取分層設(shè)置，也未重新分配各項(xiàng)權(quán)重，尚待在未來的多中心研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、確定各項(xiàng)送檢標(biāo)準(zhǔn)的權(quán)重。同時(shí)也提醒廣大臨床醫(yī)師應(yīng)盡可能同步送檢或留取腦脊液行病原mNGS測序和傳統(tǒng)病原學(xué)檢測，最終做到腦脊液mNGS測序送檢有的放矢、結(jié)果有據(jù)可依，以為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的精準(zhǔn)診斷與治療提供更加有力的保障。

利益沖突無