黃曉忠 林曙光 符永恒 劉曉穎 林秋雄 余細勇

（1廣東省人民醫(yī)院 廣州510080；2廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 廣州510080；3廣東省心血管病研究所 廣州510080；4廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 廣東廣州514436）

胰島素抵抗（Insulin Resistance,IR）是骨骼肌、脂肪和肝臟等胰島素的靶組織對胰島素刺激的葡萄糖攝取抵抗，引發(fā)代償性胰島素高分泌，導(dǎo)致糖耐量減低、高胰島素血癥、高三酰甘油血癥（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低及高血壓等疾病。IR是代謝綜合征、多囊卵巢綜合征、心血管事件、肥胖、癡呆甚至腫瘤等疾病發(fā)病機制的共同環(huán)節(jié)[1]。IR及其繼發(fā)的代謝紊亂是產(chǎn)生冠心病、糖尿病和高血壓的共同原因[2]，大約三分之一貌似健康的人存在IR并且發(fā)展成臨床疾病[3]。有效治療IR，逆轉(zhuǎn)代謝紊亂是避免和減少疾病發(fā)生的重要方法，但目前缺乏有效治療IR藥物。中藥治療具有價格低廉，療效穩(wěn)定且長期使用毒副作用小的優(yōu)勢。利用中國中醫(yī)藥資源及研究的優(yōu)勢，以期發(fā)現(xiàn)能夠治療IR的中藥制劑。建立存在IR、高血壓及高膽固醇血癥大鼠模型，采用廣東省心血管病研究所經(jīng)驗方組合成的黃荔合劑進行研究，評價其改善IR的作用。本研究采用了質(zhì)檢合格的中藥浸膏粉以一定比例混合后使用以保證效果穩(wěn)定，通過空腹血糖測定、糖耐量實驗及高胰島素正常血糖鉗夾（Clamp）技術(shù)來評價黃荔合劑對模型大鼠IR、空腹血糖受損及糖耐量異常的影響?，F(xiàn)報道如下：

1 材料

1.1 實驗動物 體質(zhì)量300~400 g成年雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）及雄性Wistar大鼠均由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。

1.2 藥材與試劑 黃芪、荔枝核、荷葉等中藥浸膏粉（購于廣東一方藥業(yè)有限公司并經(jīng)過指紋圖譜質(zhì)控，批號05110823）以一定比例組成黃荔合劑（國家發(fā) 明 專 利，專 利 號ZL200810026380.0及200810026381.5），生化檢測試劑盒（美國Beckman公司），肝素鈉注射液（國藥準字H20153264）3 750 U/kg、2%鹽酸利多卡因注射液（國藥準字H32022839）、門冬胰島素注射液（注冊證號S20140109）。

1.3 高脂高糖飼料100 g飼料中含有10 g豬油，10 g蔗糖，4 g膽固醇及0.1%丙硫氧嘧啶，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心配制。

1.4 儀器 自動生化分析儀（LX20,美國Beckman公司）、血糖儀（Advantage IV,德國羅氏公司），雙通道數(shù)字式微量注射泵（Harvard Apparatus,USA,WZS250C2型，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠）。

2 檢測方法

2.1 實驗?zāi)Ｐ椭苽?將體質(zhì)量300~400 g成年SHR大鼠24只（購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司）隨機分為SHR組、模型組、黃荔合劑組，另取8只正常血壓雄性Wista大鼠作為對照組。將各組大鼠稱重，測定血壓及尾靜脈取血后，SHR組及對照組以普通飼料喂養(yǎng)，模型組、黃荔合劑組以含丙硫氧嘧啶的高脂高糖飼料共喂養(yǎng)8周，造模4周后再進行藥物干預(yù)4周。造模后測定血壓及尾靜脈取血測定生化指標，確定建立高血壓合并高膽固醇血癥大鼠模型。

2.2 藥物干預(yù)方法 以黃荔合劑1.35 g/kg對大鼠灌胃治療，1次/d，其它組以等體積蒸餾水灌胃，每次2 ml，共治療4周。

2.3 尾動脈血壓測量 將大鼠在38℃避光烤箱加熱5~10 min后，采用生理記錄儀（Powerlab，澳大利亞）測定大鼠尾動脈血壓，選其中3次（各測定值間相差在10 mm Hg內(nèi)）取平均值為大鼠血壓。

2.4生化指標測量 造模及干預(yù)后，大鼠空腹12 h，尾靜脈取血2 ml離心后取血漿，采用自動生化分析儀及其配套試劑盒進行生化指標分析，包括空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、TG、HDL-C、低密度脂蛋白（LDL-C）等各項指標。

2.5 口服糖耐量試驗（OGTT） 藥物干預(yù)4周時，將各組大鼠空腹12 h后，從各組大鼠尾靜脈末端切口取血50 μL，采用血糖儀（Advantage IV,德國羅氏公司）及配套血糖試紙測定空腹血糖，再用20%葡萄糖溶液以2 g/kg給各組大鼠灌胃，在灌胃后15、30、60及120 min時從大鼠尾靜脈末端切口處取血50 μL同上測定即刻血糖。

2.6 高胰島素正常血糖鉗夾實驗

2.6.1 尾動脈插管術(shù) 將大鼠空腹12 h后，稱體質(zhì)量并腹腔注射肝素注射液3 750 U/kg后，將大鼠置于大鼠固定器中，用2%利多卡因0.5 ml在大鼠尾根部環(huán)狀皮下注射局麻，待尾部反射消失（用針尖刺激鼠尾無反應(yīng)）后，將鼠套翻轉(zhuǎn)，鼠尾腹面向上，在尾根部中線左側(cè)0.2 cm處沿尾縱軸作一長約1.0 cm切口。分離皮膚，可見尾動脈鞘，用微血管止血鉗分離尾動脈約0.5 cm，絲線拉緊遠心端，使用接裝有50 U/ml肝素生理鹽水注射器24 G一次性靜脈留置針穿刺尾動脈，輕輕拔出針心，絲線結(jié)扎固定導(dǎo)管，明膠海綿止血并膠布固定針體，每小時尾根部補加2%利多卡因保持局麻。

2.6.2 尾靜脈插管術(shù) 鼠尾遠側(cè)1/2~1/3處酒精或熱水局部擦洗，使血管擴張，可見到皮下尾靜脈，用24 G一次性使用靜脈留置針穿刺尾靜脈，有回血后拔出針心并向近心端推進至套管全部進入靜脈，并用膠布固定留置。靜脈輸液針內(nèi)裝有50 U/ml肝素生理鹽水，尾部與小三通管相連。

2.6.3 高胰島素-正葡萄糖糖鉗夾術(shù) 大鼠插管后靜待30 min，解除插管術(shù)可能帶來的應(yīng)激反應(yīng)。接尾靜脈小三通管的一個通道接胰島素注射液（胰島素溶于生理鹽水溶液中），另一個通道接10%葡萄糖注射液，胰島素和葡萄糖分別用雙通道數(shù)字式微量注射泵（Harvard Apparatus,USA,WZS250C2型,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠）注射。首次0 min取尾動脈血2 ml行生化和血糖檢測，用羅氏血糖儀測量血糖值，此時所測血糖為基礎(chǔ)血糖（Basic Blood Glucose,BBG）。然后以1.67 mU/（kg·min）的恒定速度輸入胰島素，5 min后取動脈血20 μL，用羅氏血糖儀測量血糖，若此時血糖低于BBG的0.5 mmol/L，則開始輸入10%葡萄糖注射液。以后每5 min測血糖1次，不斷調(diào)整葡萄糖輸入速率（Glucose Infusion Rate,GIR），使血糖保持在（BBG±0.5）mmol/L范圍內(nèi)。60 min后，若連續(xù)3次測血糖保持在上述范圍內(nèi)，即達到穩(wěn)態(tài)，此時取動脈血0.5 ml測量血漿胰島素（鉗夾穩(wěn)態(tài)胰島素），繼續(xù)上述過程，直到120 min結(jié)束，共采血24次。實驗結(jié)束后，采用60~120 min時各組平均GIR指標來反映胰島素抵抗的程度，記為GIR60~120。其中對胰島素敏感性越高GIR60~120就越大，反之機體對胰島素敏感性越低GIR60~120就越低。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件分析處理數(shù)據(jù)。計量資料均以（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血壓測定值比較 給藥前與模型組比較，SHR組血壓顯著增高，對照組顯著降低（P＜0.01）；給藥后與模型組比較，SHR組血壓顯著升高，對照組及黃荔合劑組血壓降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血壓測定值比較（mm Hg，±s）

表1 各組大鼠血壓測定值比較（mm Hg，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與模型組比較#P＜0.01。

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3.2 各組生化指標結(jié)果比較 給藥前與模型組比較，對照組除TG顯著升高外其他指標均顯著降低；SHR組TG顯著升高，TC、LDL、HDL均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；SHR組FBG，黃荔合劑組各項指標與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥后與模型組比較，對照組TG升高，TC、LDL、HDL顯著降低，SHR組TC、LDL顯著降低，黃荔合劑組HDL顯著升高，F(xiàn)BG、TC顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；除對照組外各組TG比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組生化指標結(jié)果比較（mmol/L，±s）

表2 各組生化指標結(jié)果比較（mmol/L，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與模型組比較#P＜0.01。

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3.3 干預(yù)后各組口服糖耐量試驗比較 黃荔合劑組、對照組與模型組比較，在0、15、30、60及120 min時血糖水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。SHR組與模型組比較，在0、15、30 min時血糖水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），60、120 min血糖水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表3 干預(yù)后各組口服糖耐量試驗比較（mmol/L，±s）

表3 干預(yù)后各組口服糖耐量試驗比較（mmol/L，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與模型組比較#P＜0.01。

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3.4 干預(yù)后各組GIR指標比較 黃荔合劑組大鼠GIR60~120較模型組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SHR組及對照組GIR60~120較模型組升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 干預(yù)后各組GIR指標比較（±s）

表4 干預(yù)后各組GIR指標比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

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4 討論

IR狀態(tài)下，機體對胰島素處理葡萄糖能力減退，必須以高于正常的胰島素釋放水平來維持正常糖耐量，表現(xiàn)為高胰島素血癥、空腹血糖異常及糖耐量受損。高胰島素血癥導(dǎo)致水鈉潴留，刺激血管平滑肌細胞增殖，交感神經(jīng)系統(tǒng)及腎素血管緊張素系統(tǒng)活性增強，具有升高血壓的作用[4]。IR導(dǎo)致高TG、低HDL血癥、增高小而致密LDL水平及ApoAⅠ/ApoB100比值降低等脂質(zhì)代謝紊亂狀態(tài)[5]。

目前除通過減肥、鍛煉等生活方式改變（Therapeutic Lifestyle Changes,TLC）改善IR外，也使用他汀類調(diào)脂藥、雙胍類降糖藥、抗高血壓藥（ACE抑制劑、ARB、α受體阻斷劑等）、過氧化物酶增殖體激活物受體（PPARs）α、γ激動劑等治療IR，對改善IR有一定作用，但存在用藥種類及藥物不良反應(yīng)多，療效欠佳，社會及患者的經(jīng)濟負擔重等問題。進一步尋找和開發(fā)方便、有效、相對安全且經(jīng)濟的治療方法具有重要的臨床意義。

黃芪主要成分包括黃酮、生物堿和黃芪多糖等。黃芪通過促進脂肪細胞凋亡增加，減少抵抗素及脂聯(lián)素等細胞因子分泌，改善飲食導(dǎo)致的胰島素抵抗，并與羅格列酮療效相當[6]。黃芪多糖干預(yù)肌肉組織PKB/GLUT4信號通路糾正了KKAy小鼠IR[7]，荔枝核具有降血糖、增強胰島素抵抗模型大鼠胰島素敏感性等藥理作用[8]，荷葉具有調(diào)脂、降糖等藥理作用[9]。本研究利用黃芪、荔枝核、荷葉等浸膏粉組成黃荔合劑，可以保證藥物療效及組方的穩(wěn)定性。

IR檢測方法多樣，但目前評價IR的“金標準”是高胰島素正常血糖鉗夾（Clamp）試驗，該方法可有效糾正內(nèi)源性胰島素缺乏對研究結(jié)果的影響。但存在操作復(fù)雜、費時且價格高等問題，很少在研究中使用。目前研究多使用操作簡便，與Clamp試驗有一定相關(guān)性的如穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）和定量胰島素敏感性指標（QUICKI）等來評價IR，其證據(jù)強度低于Clamp。

本研究最大特色是創(chuàng)新性地采用Clamp技術(shù)證實SHR組及模型組大鼠存在IR，模型組大鼠IR更加嚴重。與既往研究一致，本研究證實存在嚴重IR的大鼠模型具有空腹血糖受損、糖耐量受損等病理特征。本研究使用SHR大鼠具有高血壓、低HDL、胰島素抵抗、空腹血糖受損及糖耐量異常等特點，通過含丙硫氧嘧啶的高膽固醇飼料喂養(yǎng)后產(chǎn)生高膽固醇血癥。

黃荔合劑干預(yù)模型大鼠4周后，顯著升高了HDL，降低了空腹血糖、改善糖耐量受損及胰島素抵抗，具有顯著改IR導(dǎo)致的代謝紊亂作用。既往研究表明黃荔合劑劑量依賴性增高主動脈過氧化物酶體增殖物受體γ（Peroxisome Proliferators-Activated Receptor,PPAR-γ）基因及蛋白的表達[10]。黃荔合劑激活PPAR-γ，可以顯著增加組織對葡萄糖的攝取，增加胰島素敏感性，可能是其改善胰島素抵抗的作用機制之一。黃荔合劑治療合并IR的高血壓合并高膽固醇血癥大鼠，降低了空腹血糖，顯著改善了糖耐量受損及胰島素抵抗，可能與黃荔合劑可能增加PPAR-γ基因復(fù)制及其蛋白表達，干預(yù)肌肉組織PKB/GLUT4信號通路等有關(guān)，對合并IR的高血壓合并高膽固醇血癥綜合防治可能有良好的前景。本實驗還需進一步進行臨床研究。