王衛(wèi)忠 何雪倩 馮杜金 陳燕敏 趙釗

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一[1]。其發(fā)病率逐年上升，每年全球新發(fā)病例達(dá)115萬，占全球女性惡性腫瘤的22.7%，死亡病例達(dá)41萬，占所有女性惡性腫瘤死亡的14.1%，其死亡率在女性惡性腫瘤中位居第二，嚴(yán)重威脅婦女健康[2]。雖然近年來隨著診斷和治療技術(shù)的提高，乳腺癌的病死率已大大降低，但由于乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，不同乳腺癌患者的預(yù)后存在較大差異。發(fā)現(xiàn)新的乳腺癌預(yù)后生物標(biāo)志物，以實(shí)現(xiàn)乳腺癌的個體化預(yù)后評估具有重要的臨床意義。

研究表明，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）的表達(dá)或功能異常與癌癥、退行性神經(jīng)疾病在內(nèi)的多種人類重大疾病的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]。lncRNA的表達(dá)具有細(xì)胞或組織特異性，其或可成為潛在的癌癥生物標(biāo)志物[5]。增強(qiáng)子是基因組中順式調(diào)節(jié)元件的主要類型，通過與靶基因啟動子相互作用從而增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。近年來發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子也能轉(zhuǎn)錄lncRNA，稱為增強(qiáng)子RNA（enhancer RNA,eRNA）。在人類細(xì)胞中已經(jīng)鑒定出數(shù)以萬計的eRNA。eRNA可以介導(dǎo)靶基因的激活，從而在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中，癌基因或致癌信號通路的激活通常會伴隨著增強(qiáng)子的激活以及eRNA的產(chǎn)生。已有研究表明eRNA在腫瘤發(fā)生中存在重要作用，暗示它們可作為臨床治療、預(yù)測預(yù)后的潛在靶標(biāo)[6]。基底細(xì)胞癌中肌動蛋白相關(guān)蛋白T1（actin-related protein T1,ACTRT1）相關(guān)eRNA的突變可能削弱增強(qiáng)子的活性和ACTRT1的表達(dá)，從而導(dǎo)致Hedgehog信號通路的異常激活，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[7]。在乳腺癌中可以檢測到神經(jīng)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因 1（neuroepithelial cell transforming 1,NET1）相關(guān)的eRNA高表達(dá),這是一個位于癌基因NET1下游約90 kb的eRNA，敲低NET1e顯著降低了乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的增殖，并且NET1e表達(dá)水平與藥物反應(yīng)性相關(guān)[8]。但是，之前的研究主要集中在單個或幾個eRNA與乳腺癌之間的關(guān)系，目前利用大數(shù)據(jù)篩選分析與乳腺癌相關(guān)的eRNA研究還不多見?；诖耍狙芯客ㄟ^人類癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas,TCGA）數(shù)據(jù)庫篩選出與乳腺癌預(yù)后相關(guān)的eRNA及其靶基因，分析其與臨床特征的相關(guān)性，并對其在泛癌中的表達(dá)進(jìn)行研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 乳腺癌預(yù)后相關(guān)eRNA的篩選 下載獲得由PreSTIGE算法[9]預(yù)測的組織特異性增強(qiáng)子表達(dá)的lncRNA及其預(yù)測靶標(biāo)的列表，得到2 695個組織特異性增強(qiáng)子表達(dá)的lncRNA轉(zhuǎn)錄本以及2 303個相關(guān)預(yù)測靶基因。通過Ensembl基因組序列數(shù)據(jù)庫將列表中的“Ensembl ID”轉(zhuǎn)換為“gene symbol”，將 2 695 個 eRNA 轉(zhuǎn)錄本定位到對應(yīng)的1 288個基因[10-11]。從UCSC Xena癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)分析平臺下載TCGA數(shù)據(jù)庫中33種腫瘤的RNA測序數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)，研究TCGA中相應(yīng)癌癥數(shù)據(jù)中eRNA的表達(dá)水平及其臨床特征相關(guān)性。通過基因共表達(dá)分析，以評估eRNA水平與靶基因之間的相關(guān)性。關(guān)鍵eRNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)為與總生存期（P＜0.05）以及與其靶基因共表達(dá)（r＞0.4，P＜0.001）明顯相關(guān)。

1.2 統(tǒng)計學(xué)處理 采用R統(tǒng)計軟件。采用Kruskal-Wallis H檢驗比較不同類型腫瘤之間的基因表達(dá)差異。采用非參數(shù)Wilcoxon符號秩檢驗比較匹配的腫瘤和非腫瘤樣本間的基因差異。采用Spearman等級相關(guān)系數(shù)評估兩組變量關(guān)系密切程度。采用Kaplan-Meier方法計算不同風(fēng)險組的總體生存時間，進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌預(yù)后相關(guān)eRNA篩選結(jié)果 通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中1 217例乳腺癌患者的RNA測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)91個eRNA的表達(dá)水平與乳腺癌患者的總體生存率顯著相關(guān)（P＜0.05）。隨后將這91個eRNA的表達(dá)水平與其靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，得到30個預(yù)后相關(guān)eRNA的表達(dá)水平與其靶基因的表達(dá)水平呈顯著相關(guān)（Spearman等級相關(guān)系數(shù)r＞0.4，P＜0.001）。見表1。

表1 與乳腺癌預(yù)后相關(guān)的eRNA

2.2 AP003059.2是乳腺癌的關(guān)鍵eRNA 由表1可見，AP003059.2是與乳腺癌總體生存率相關(guān)性最強(qiáng)的eRNA。與AP003059.2低表達(dá)組相比，AP003059.2高表達(dá)組顯示出更高的總體生存率（圖1a）。AP003059.2的基因表達(dá)與靶基因ME3表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（圖1b）。通過limma包分析乳腺癌中與AP003059.2共表達(dá)相關(guān)的基因，主要包括蘋果酸酶3（malic enzyme 3,ME3）、AP001148.1、ZNF540、CBX7、RAD51-AS1、AP000654.1、GTF2IRD2、LINC01359、PRSS23、RBM5、AP003059.1、TRMT9B、CROCCP3等13個基因。

圖1 增強(qiáng)子RNA（eRNA）AP003059.2與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系[a：AP003059.2高表達(dá)和低表達(dá)乳腺癌患者的總生存曲線比較；b：AP003059.2和蘋果酸酶3（ME3）共表達(dá)關(guān)系分析]

2.3 eRNA AP003059.2與激素表達(dá)狀態(tài)的相關(guān)性分析 與雌激素受體（estrogen receptor,ER）陰性腫瘤相比，ER陽性腫瘤表達(dá)更高水平的AP003059.2（P＜0.001，圖2a）。而與人表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2） 陰性腫瘤相比，HER-2陽性腫瘤表達(dá)較低水平的AP003059.2（P＜0.001，圖 2b）。與孕激素受體（progesterone receptor,PR）陰性腫瘤相比，PR陽性腫瘤表達(dá)更高水平的AP003059.2（P＜0.001，圖2c）。上述結(jié)果表明在不同激素受體表達(dá)乳腺癌中，AP003059.2的表達(dá)存在差異，可能為乳腺癌個體化治療及預(yù)后分析提供新的靶標(biāo)。

圖2 雌激素受體（ER）、人表皮生長因子受體2（HER-2）、孕激素受體（PR）陽性與陰性乳腺癌中增強(qiáng)子RNA（eRNA）AP003059.2的表達(dá)差異（a：ER陽性與陰性乳腺癌比較；b：HER-2陽性與陰性乳腺癌比較；c：PR陽性與陰性乳腺癌比較）

2.4 eRNA AP003059.2在泛癌中的表達(dá) 通過對33種腫瘤中AP003059.2的表達(dá)與腫瘤總體生存率以及與ME3共表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)僅在乳腺癌中，AP003059.2與腫瘤總體生存率以及ME3共表達(dá)存在相關(guān)性，表明AP003059.2在乳腺癌組織中特異性表達(dá)，具有組織特異性。見表2。

表2 33種腫瘤中AP003059.2表達(dá)水平與患者生存預(yù)后分析及與蘋果酸酶3（ME3）基因表達(dá)相關(guān)性分析

3 討論

eRNA是基因增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)衍生的特定亞類lncRNA，能夠以順式作用影響相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。為了增進(jìn)對乳腺癌中eRNA的了解，本研究使用以下方法來鑒定BRCA中與預(yù)后相關(guān)的eRNA：（1）從已發(fā)表文獻(xiàn)得到組織特異性增強(qiáng)子表達(dá)的lncRNA及其相關(guān)靶基因列表；（2）下載TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌數(shù)據(jù)，分析eRNA的表達(dá)與乳腺癌總體生存率的相關(guān)性；（3）通過eRNA與靶基因的相關(guān)性分析進(jìn)一步篩選。該方法篩選得到了影響乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)eRNA，也可用于具有足夠RNA測序數(shù)據(jù)的其他人類疾病eRNA的研究。

本研究結(jié)果顯示，目前功能尚未注釋的lncRNA AP003059.2被確定為與乳腺癌預(yù)后最相關(guān)的eRNA。在TCGA數(shù)據(jù)庫的33種癌癥中，AP003059.2的表達(dá)對乳腺癌總體生存率的影響最大，而與其他31種腫瘤存活率無明顯相關(guān)性，具有明顯的組織特異性，這或可使其成為預(yù)測乳腺癌預(yù)后的關(guān)鍵eRNA。AP003059.2位于ME3基因的增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)，與ME3的表達(dá)之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。ME3是蘋果酸酶家族的關(guān)鍵成員，在胰島素釋放和上皮細(xì)胞間質(zhì)化等多個生理和病理過程中發(fā)揮重要作用[12]。ME3作為一種氧化性脫羧酶，可催化蘋果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，是還原型輔酶Ⅱ再生和活性氧（reactive oxygen species,ROS）穩(wěn)態(tài)所必需的。ROS既可以作為信號分子，又可以作為細(xì)胞死亡的介體，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。已有研究證明胰腺癌組織中ME3的表達(dá)高于正常胰腺組織，ME3表達(dá)的增加可能在胰腺癌的發(fā)展中起重要作用，并作為胰腺癌發(fā)生和進(jìn)展的生物標(biāo)志物[13]。研究表明，蘋果酸酶可能是抑制包括肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌、皮膚黑色素瘤和鼻咽癌在內(nèi)的多種腫瘤生長和侵襲的靶標(biāo)[14-15]。靶向ME3可能是抑制腫瘤生長的有效方法，高特異性的ME3抑制劑可以為相當(dāng)一部分癌癥患者提供有效的治療方法[16]。

本研究也發(fā)現(xiàn)AP003059.2的表達(dá)與乳腺癌組織中的激素受體表達(dá)狀態(tài)相關(guān)。與ER陰性的乳腺癌相比，ER陽性的AP003059.2水平更高；與PR陰性的乳腺癌相比，PR陽性的AP003059.2水平更高；而在HER-2陰性的乳腺癌中，AP003059.2水平更高。這些結(jié)果表明乳腺癌作為一種異質(zhì)性很高的惡性腫瘤，必須綜合考慮各種激素受體的表達(dá)情況，才能對不同類型乳腺癌的預(yù)后和個體化治療方案作出精確判斷。

由于AP003059.2是功能未注釋的轉(zhuǎn)錄本，本研究試圖通過鑒定除其預(yù)測的靶標(biāo)ME3外的其他共表達(dá)基因來闡明其作用。除ME3外，本研究還發(fā)現(xiàn)其他12個與AP003599.2具有顯著表達(dá)相關(guān)性的基因。但是轉(zhuǎn)錄本之間的相關(guān)性并不一定表示兩者之間具有因果關(guān)系，AP003059.2是否具有相應(yīng)靶基因的增強(qiáng)子活性仍有待通過實(shí)驗確定。

總之，AP003059.2是乳腺癌的組織特異性eRNA，與乳腺癌的預(yù)后明顯相關(guān)，或可作為乳腺癌患者潛在預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。