周少丞 季曉春 滕偉峰 張佳男 毛琦淇

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。在全世界范圍內(nèi)，乳腺癌約占女性惡性腫瘤總發(fā)病率的25%，女性腫瘤相關(guān)死亡率的15%[1]。腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移與血管生成密不可分。由于在腫瘤微環(huán)境的影響下，腫瘤血管在形態(tài)、功能、基因表達(dá)上與正常的血管存在著較大的差異[2]。因此，如何有效地控制腫瘤血管的生長對治療乳腺癌具有重要意義。miRNA作為廣泛存在于真核生物中的一類長度為18～26個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA的3'UTRs互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平降解mRNA或者在翻譯水平抑制蛋白質(zhì)的合成，從而達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的作用。miR205最初是在研究鼠和紅鰭東方豚的同源序列時通過在線預(yù)測網(wǎng)站MiRscan預(yù)測發(fā)現(xiàn)的，之后證實(shí)在人體中也有表達(dá)。miR205與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，在不同的腫瘤中其表達(dá)水平不同，如在前列腺癌[3]中低表達(dá)，在非小細(xì)胞肺癌[4]、黑色素瘤[5]及頭頸部鱗癌[6]等腫瘤中高表達(dá)。鼠雙微體2基因（mouse double minute 2,MDM2）作為一種進(jìn)化相對保守的基因，通過調(diào)節(jié)p53的功能影響細(xì)胞周期起到重要作用。miR205-3p在BC-ECs中的表達(dá)情況鮮有報道，且miR205-3p能否通過調(diào)控MDM2的表達(dá)參與對乳腺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞（breast cancer-endothelial cells,BC-ECs）增殖的影響尚不明確。基于此，本研究旨在分析miR205-3p調(diào)控BC-ECs增殖的作用機(jī)制，探討乳腺癌臨床治療可行的分子靶點(diǎn)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 3種乳腺癌細(xì)胞株（MCF7、MDA-MB-453、MDA-MB-231）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。NOD SCID小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司。EGM血管內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基購自瑞士Lonza公司。FBS購自美國Gibco公司。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。無菌超凈工作臺購自中國蘇州金凈有限公司。細(xì)胞CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司。小型臺式離心機(jī)購自德國Eppendorf公司。細(xì)胞T25培養(yǎng)瓶購自美國Corning公司。超低吸附六孔板購自美國Corning公司。六孔板購自美國Costar公司。μ-Slide血管生成培養(yǎng)板購自德國ibidi公司。2.5 μl、10 μl、20 μl、100 μl、1 ml移液槍均購自美國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 3種乳腺癌細(xì)胞株和HUVEC使用含10%FBS、100 μg/ml鏈霉素和 100 U/ml青霉素的 RPMI 1640或DMEM完全培養(yǎng)基，置于5%CO2的37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長超過80%后，利用胰淀粉酶進(jìn)行消化后傳代或凍存。

1.3.2 建模與BC-ECs提純 3種乳腺癌細(xì)胞種植于小鼠背部皮下，成瘤后的乳腺癌組織分別剪成0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm的小塊，加入含0.1%膠原酶Ⅰ的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基震蕩消化，經(jīng)過濾、洗滌后加入抗CD105抗體交聯(lián)免疫磁珠。細(xì)胞懸液加入分選柱進(jìn)行分選，收集被磁珠標(biāo)記的陽性細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng)，最終得到BC-ECs。

1.3.3 免疫組織熒光檢測CD105及CD31蛋白表達(dá)成瘤后的乳腺癌組織甲醛固定后，制作石蠟切片，脫蠟、修復(fù)后分別用抗CD105抗體和抗CD31抗體4°C孵育過夜，第2天沖洗后，分別用FITC標(biāo)記的二抗和羅丹明標(biāo)記的二抗避光孵育，再次沖洗后進(jìn)行細(xì)胞核DAPI染色，熒光鏡下觀察。

1.3.4 血管內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前1 d將Matrigel基質(zhì)膠于4°C融化。實(shí)驗(yàn)時在μ-Slide血管生成培養(yǎng)板的每個孔中加入10 μl Matrigel。然后將μ-Slide板放入培養(yǎng)皿中，加入吸滿水的吸水紙以防止μ-Slide板中水分蒸發(fā)。培養(yǎng)皿在培養(yǎng)箱中放置30 min使膠凝固；同時開始準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，即BC-ECs和HUVEC，細(xì)胞消化后將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為2×105個/ml；取出μ-Slide板，每孔加入50 μl細(xì)胞懸液，然后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每隔4～6 h用光學(xué)顯微鏡拍攝實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.5 血管內(nèi)皮細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn) 將BC-ECs和HUVEC分別接種于24孔板中，培養(yǎng)48 h；吸去培養(yǎng)基，用無血清的EGM血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h；加入無血清的EGM培養(yǎng)基配制的DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―iI-ac-LDL）（10 μg/ml），37 °C 孵育 4 h；吸去培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，去除未結(jié)合的DiI-ac-LDL；加入完全培養(yǎng)基，熒光顯微鏡觀察。

1.3.6 實(shí)時熒光定量PCR檢測miR205-3p表達(dá) 提取3種細(xì)胞成瘤組織中的BC-ECs及HUVEC的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件16℃30 min，45℃ 30 min，85℃ 5 min。運(yùn)用 SYBR Green法檢測miR205-3p的表達(dá)情況，運(yùn)用反應(yīng)條件94℃15 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán)40 次；最后 72 ℃延伸6 min。每組樣品重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計分析標(biāo)本中miR205-3p的表達(dá)情況。

1.3.7 熒光素酶報告基因檢測 利用靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫 Target Scan網(wǎng)站（http://www.targetscan.org）預(yù)測miR205-3p的靶基因。發(fā)現(xiàn)miR205-3p的5'端可與MDM2 mRNA的3'UTR區(qū)特異性結(jié)合，推測MDM2是miR205-3p的靶基因。為驗(yàn)證這一預(yù)測，構(gòu)建突變型MT-MDM2和野生型WT-MDM2的MDM2的3'-UTR熒光素酶報告基因載體，利用Lipofectamine 3000將miR205-3p和miR-NC（陰性對照）分別與MT-MDM2和WT-MDM2共轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞中，然后將各組MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞，通過雙熒光素酶報告檢測試劑盒（美國Promega公司）檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.3.8 Western blot檢測MDM2蛋白的表達(dá) 提取組織總蛋白，SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉后，加入一抗（MDM2 1∶200）4 °C孵育過夜。TBST洗膜3次，接著加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育1 h后，再用TBST洗膜。最后進(jìn)行顯影拍照。

1.3.9 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力 將BC-ECs分成3組，空白對照組（Mock組）、陰性對照組（miR-NC組）和實(shí)驗(yàn)組（miR205-3p組），接種于96孔板中，培養(yǎng)24、48、72 h，每個時點(diǎn)每孔加入20 μl MTT試劑后繼續(xù)培養(yǎng)4 h吸出培養(yǎng)基，再加入150 μl DMSO試劑，檢測各孔570 nm處的吸光值。

1.3.10 乳腺癌小鼠移植瘤模型建立 將小鼠20只隨機(jī)分成Blank組（空白對照組）和miRNA激動劑miR205-3p agomir組（實(shí)驗(yàn)組），每組10只。將MDA-MB-231制備成1×107/ml的細(xì)胞懸液，接種于每只小鼠背部皮下。同時，尾靜脈分別注射0.9%氯化鈉注射液或miR-205-3p agomir 2 nmol，注射1次/4 d，觀察成瘤時間，每周測量小鼠瘤體大小，計算腫瘤體積，繪制生長曲線，28 d后處死小鼠，獲得腫瘤組織。腫瘤體積=長徑×短徑2×0.5（cm3）。

1.4 觀察指標(biāo) （1）驗(yàn)證分選所得的BC-ECs的純度及其內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能。（2）驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測得到miR205-3p的靶基因MDM2，并通過改變miR205-3p的表達(dá)水平，是否可以改變BC-ECs的生物學(xué)功能。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌移植瘤中人源性血管內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)、BC-ECs的提純及其內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能檢測結(jié)果 將乳腺癌細(xì)胞株（MDA-MB-231）細(xì)胞懸液種植于NOD SCID小鼠背部皮下后形成移植瘤，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)，可見人源性內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物CD105和CD31的表達(dá)（圖1，見插頁）。

圖1 免疫熒光檢測MDA-MB-231成瘤組織中人源性血管內(nèi)皮表面標(biāo)記物CD105和CD31的表達(dá)（×100）

通過抗CD105磁珠分選，從MDA-MB-231移植瘤組織中純化得到BC-ECs，鏡下可見其與HUVEC均呈鵝卵石樣形態(tài)（圖2a，見插頁）。運(yùn)用內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)和內(nèi)皮細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)對BC-ECs和HUVEC進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞功能鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BC-ECs和HUVEC能在Matrigel膠上形成管腔樣結(jié)構(gòu)（圖2b，見插頁），并能夠吞噬ac-LDL后發(fā)出紅色熒光（圖2c，見插頁）。

圖2 乳腺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞（BC-ECs）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）細(xì)胞形態(tài)及內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能檢測[a：光鏡下所見（×400）；b：內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)光鏡下所見（×200）；c：內(nèi)皮細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)光鏡下所見（×400）]

2.2 BC-ECs miR205-3p表達(dá)水平檢測結(jié)果及靶基因的預(yù)測、鑒定結(jié)果 實(shí)時熒光定量PCR檢測3種乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231、MDA-MB-453及 MCF-7）成瘤組織中的BC-ECs及HUVEC miR-205-3p的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BC-ECs中miR205-3p的表達(dá)水平相比HUEVC 明顯降低（P＜0.05，圖 3）。

圖3 在乳腺癌血管內(nèi)皮細(xì)胞（BC-ECs）與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的miR205-3p表達(dá)水平比較（*P＜0.05）

根據(jù)Target Scan生物軟件分析，發(fā)現(xiàn)miR205-3p與MDM2的3'UTR區(qū)有一處高度匹配，位于62～68位置（圖4a）。野生型MDM2基因熒光素酶表達(dá)載體WTMDM2與miR205-3p共轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，miR205-3p組MDA-MB-231細(xì)胞熒光素酶活性較miR-NC組顯著降低（P＜0.05），而突變型MDM2基因熒光素酶表達(dá)載體MT-MDM2和miR-205-3p共轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，miR-205-3p組MDA-MB-231細(xì)胞熒光素酶活性較miR-NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖4b），證實(shí)MDM2為miR205-3p的潛在靶點(diǎn)，miR205-3p可負(fù)性調(diào)控MDM2的表達(dá)。

圖4 miR205-3p與鼠雙微體2基因（MDM2）3'UTR區(qū)結(jié)合（a：生物信息學(xué)分析miR205-3p與MDM2的3'UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)；b：熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR205-3p與靶基因MDM2的3'UTR 區(qū)結(jié)合，*P＜0.05）

2.3 BC-ECs過表達(dá)miR205-3p后MDM2蛋白表達(dá)及增殖能力變化 Western blot檢測結(jié)果顯示過表達(dá)miR205-3p后，MDM2在BC-ECs中表達(dá)降低（圖5a）。同時，轉(zhuǎn)染miR205-3p后，BC-ECs的增殖能力在同時間段檢測時的OD值明顯低于陰性對照組及空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖5b）。

圖5 miR205-3p靶向鼠雙微體2基因（MDM2）影響B(tài)C-ECs的增殖能力（a：BC-ECs中MDM2蛋白表達(dá)電泳圖；b：3組BC-ECs增殖能力比較，*P＜0.05）

2.4 注射miR205-3p agomir對體內(nèi)移植瘤生長的影響接種28 d后測量移植瘤體積空白對照組和miR205-3p agomir組分別為（1.19±0.14）cm3和（0.54±0.09）cm3。miR205-3p agomir組移植瘤體積明顯小于空白對照組（P＜0.05，圖 6）。

圖6 注射miR205-3p激動劑對體內(nèi)移植瘤生長的影響（a：移植瘤體積生長曲線圖；b：實(shí)驗(yàn)組和對照組的移植瘤組織照片）

3 討論

乳腺癌是我國女性發(fā)病率第一位的惡性腫瘤[7]。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中伴隨著大量功能基因表達(dá)的變化、表觀遺傳學(xué)的變化及多種分子交互作用的變化。因此，探討乳腺癌發(fā)生與發(fā)展過程中的分子作用機(jī)制對其提高治療效果、改善預(yù)后起到十分重要的作用。

miRNA是一類長度為22個核苷酸，可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因標(biāo)的的非編碼RNA[8]。近年來，大量的研究發(fā)現(xiàn)miRNA作為癌基因或抑癌基因調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲及凋亡，參與到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過程中，在癌癥的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、治療及預(yù)后中起到了重要的生物學(xué)功能調(diào)控作用。miR-205位于人染色體（1q32.2）LOC642587基因座中的第2個內(nèi)含子中，在腦膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR205可通過靶向調(diào)控TBX18，抑制其侵襲能力，起到抑癌的作用[9]。在前列腺癌中，提高miR205的表達(dá)可靶向ZEB1基因來抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。也有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR205可抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)，同時激活A(yù)KT和下調(diào)GSK-3β促進(jìn)Snail蛋白的表達(dá)，達(dá)到抑制子宮內(nèi)膜癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。在乳腺癌的相關(guān)研究中，miR205的表達(dá)通常都是降低的。有研究顯示，高轉(zhuǎn)移性乳腺癌中miR205的表達(dá)水平相對于低轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞更低[12]。在三陰性乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR205在三陰性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)極低，當(dāng)過表達(dá)miR-205后，三陰性乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力均下降，其機(jī)制在于miR205負(fù)向調(diào)控整合素α5，抑制Src/Vav2/Rac1途徑，降低癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)功能[13]。綜上研究可以發(fā)現(xiàn)，miR205在乳腺癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展中具有密切的相關(guān)性。

但是，miRNA在腫瘤血管中的研究卻鮮有報道。1971年，F(xiàn)olkman等[14]首次提出了腫瘤生長的血管依賴性，血管生成是腫瘤生長的必要條件，腫瘤發(fā)生后進(jìn)一步生長必須依賴血管的生成。Endoglin（CD105）是一種表達(dá)于增殖活躍的內(nèi)皮細(xì)胞的同型二聚體跨膜糖蛋白[15]。眾多研究表明，CD105涉及血管的生成，認(rèn)為是一種腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面非常特異性的標(biāo)志物[16-17]。通過免疫組化染色結(jié)果表明：在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌等惡性腫瘤組織中，采用Endoglin標(biāo)記微血管密度明顯優(yōu)于CD31、CD34等相關(guān)抗原標(biāo)記的結(jié)果，可作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)[18-19]。因此，本研究選用CD105作為腫瘤來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物，從乳腺癌皮下成瘤組織中提純得到的CD105+細(xì)胞（即BC-ECs），通過鏡下觀察、成管實(shí)驗(yàn)和內(nèi)皮細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有內(nèi)皮細(xì)胞功能；接著通過實(shí)時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，BC-ECs中的miR205-3p表達(dá)水平相比HUCVE降低。這提示miR205-3p可能作為一個抑癌基因在BC-ECs的生物學(xué)功能中起重要的調(diào)控作用。

人MDM2基因位于12號染色體長臂12q[20]。其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)于人體的多種器官，其中骨骼肌含量最高，與細(xì)胞基本生理活動有關(guān)[21-22]。MDM2最重要的作用是抑制p53基因的激活轉(zhuǎn)錄功能和抗腫瘤活性，其編碼蛋白產(chǎn)物p90與p53蛋白結(jié)合，促進(jìn)p53蛋白的降解，從而抑制腫瘤的增殖能力[23]。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR205-3p可能與MDM2基因的mRNA 3'UTR區(qū)特異性結(jié)合。筆者通過熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR205-3p與MDM2 mRNA 3'UTR具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并結(jié)合Western blot實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)提高miR205-3p的表達(dá)水平后，MDM2蛋白的表達(dá)受到抑制。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR205-3p通過靶向調(diào)控MDM2參與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的調(diào)控，在體外實(shí)驗(yàn)中，把miR205-3p mimics轉(zhuǎn)染BC-ECs后，其增殖受到抑制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，把miR205-3p agomir通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)后，乳腺癌皮下瘤組織生長速度降低。以上結(jié)果提示，miR205-3p通過調(diào)控MDM2表達(dá)來抑制BC-ECs的增殖，間接抑制乳腺癌組織的生長。

綜上所述，miR205-3p在BC-ECs中呈低表達(dá)，上調(diào)miR205-3p靶向MDM2蛋白表達(dá)降低，可抑制BCECs的增殖。因此，miR205-3p有望成為抗乳腺癌血管治療的潛在靶點(diǎn)。