趙穎，辛夏青，魏小紅

（1.甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室，甘肅 蘭州730070；3.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州730070）

氮素是構成蛋白質和核酸的重要元素，是農作物生長發(fā)育不可缺少的3個要素之一。植物只有在固氮酶的催化下把NO3－，NO2－或NH4+無機氮轉換為含氮化合物才可被植物吸收利用。硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）、谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT）及谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）是植物氮代謝的主要酶［1］，其活性反映了氮代謝的轉運速度［2］。高水平的氮代謝可以促進氮的同化，合成脯氨酸和蛋白質等滲透調節(jié)物質維持水分平衡［3］。近年來，在小麥（Triticum aestivum）［4］、玉米（Zea mays）［5］、馬鈴薯（Solanum tuberosum）［6］以及大豆（Glycine max）［7］等植物中發(fā)現氮素與干旱脅迫有交互關系，可通過改善氣孔導度、光合速率、抗氧化酶活性提高植物對干旱脅迫的適應性［8－10］，這說明氮代謝在植物抗旱中具有重要作用。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是我國西北干旱半干旱地區(qū)種植面積最廣的優(yōu)質多年生豆科牧草，也是畜牧業(yè)生產中不可或缺的主要植物蛋白資源，但干旱制約了其生長與品質［11－12］。Santantonio等［13］通過QTL定位發(fā)現苜蓿在干旱下的產量和水分利用效率與碳氮代謝顯著相關。此外，干旱影響土壤氮素有效性和苜蓿對氮素的吸收同化能力［14］。一氧化氮（nitric oxide，NO）作為一種生物活性分子，參與調控植物生長發(fā)育及非生物脅迫響應［15－16］。研究表明，NO通過調節(jié)紫花苜?？寡趸富钚裕?7］、非結構性碳水化合物代謝［18］、苯丙烷類代謝［19］、光合能力［20］來響應干旱脅迫，促進干旱下紫花苜蓿種子的萌發(fā)與幼苗的生長。然而，NO是否參與調控干旱脅迫下紫花苜蓿氮代謝還未見報道。

因此，本研究以NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）及NO清除劑（c-PTIO）為調控手段，探討NO在調控干旱脅迫下紫花苜蓿含氮化合物含量及氮素代謝中的作用及氮素合成代謝的調節(jié)機制，以期為揭示紫花苜蓿耐旱機理與提高紫花苜?？购的芰μ峁├碚摶A。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗于2018年1－3月在甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院植物生物技術實驗室進行。供試紫花苜蓿種子由甘肅省農業(yè)科學院提供，品種為“三得利”，千粒重2.0223 g。NO供體硝普鈉［Na2Fe（CN）5］（SNP）和NO清除劑2-（4-羧苯基）-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-烴氧基-3-氧化鈉鹽（C14H16KN2O4）［2-（4-carboxy-2-phenyl）-4，4，5，5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide，c-PTIO］，購自Sigma公司。

共設6個處理：蒸餾水；15% PEG-6000；0.1 mmol·L－1SNP；15% PEG+0.1 mmol·L－1SNP；200 μmol·L－1c-PTIO；15% PEG+200 μmol·L－1c-PTIO［21］。篩選籽粒飽滿的種子用0.1%氯化汞溶液消毒5 min，蒸餾水洗滌去除殘留。1）萌發(fā)試驗：將50粒種子均勻放在墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中（直徑9 cm），按實驗設計分別添加4 mL處理液，每24 h更換一次，每處理重復3次；在干旱處理的第2、4、6、8天隨機取種子樣品用于指標測定，每試驗重復3次。2）幼苗試驗：將種子均勻播種在裝有等量營養(yǎng)土的花盆（口徑12 cm），待生長30 d后定苗（每盆30株），并按試驗設計進行處理。SNP與c-PTIO采用葉面噴施的方式，PEG采用澆灌的方式，每隔24 h處理一次。分別在處理的第2、4、6、8天取幼苗功能葉片用于指標的測定，每個試驗3次重復。以上試驗材料均在25℃，光周期為12 h光照/12 h黑暗，光照強度為4000 lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 測定方法

采用李合生［22］的方法測定NR活性；參考鄒琦［23］的方法測定GS活性；根據Singh等［24］的方法測定GOGAT及GDH活性。參照李合生［22］的水合茚三酮法略作改動測定游離氨基酸總量。參照陳建勛等［25］的方法和考馬斯亮藍G-250法測定總蛋白含量；參照李合生［22］的方法測定可溶性蛋白含量。

采用不連續(xù)系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳。當指示劑溴酚藍到達凝膠前沿1～2 cm處，完成電泳。取出凝膠垂直板，將凝膠從玻璃板中剝離浸泡在考馬斯亮藍染色液中，用微波爐染色3～7 min，然后用脫色液（水∶甲醇∶乙酸=5∶3∶3）反復脫色，每次脫色時間約10 min，當膠塊背景清晰，蛋白條帶明顯時進行拍照［16］。

1.3 數據分析

采用Excel 2007軟件進行數據處理和作圖，SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析（P＜0.05），E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進行成像，Adobe Photoshop CC 2019軟件對電泳圖剪輯。

2 結果與分析

2.1 NO對PEG脅迫下紫花苜蓿氮代謝相關酶活性的影響

2.1.1 NO對PEG脅迫下紫花苜蓿NR活性的影響 紫花苜蓿種子萌發(fā)期NR活性隨時間推移逐漸增加（圖1A）。在各時間點，PEG+SNP處理NR活性均最高，且在第8天達到最大值。PEG+c-PTIO較PEG處理在第2、6、8天時，NR活性均無顯著差異，而在第4天時，NR活性提高了19.26%。正常情況下外源施加SNP，NR活性顯著增加，而施加c-PTIO對NR活性無顯著影響。

紫花苜蓿幼苗葉片中NR活性隨時間推移逐漸上升。PEG+SNP較PEG處理NR活性在第4，6，8天分別顯著增加了13.97%、11.50%、16.31%，而PEG+c-PTIO較PEG處理NR活性無顯著差異。c-PTIO處理與CK相比，第2，4，6天時差異不顯著，第8天時NR活性顯著降低了7.94%。因此，施加SNP能提高紫花苜蓿種子萌發(fā)期及其幼苗葉片中NR活性，而施加c-PTIO對NR活性的影響不顯著（圖1B）。

圖1 NO對PEG脅迫下紫花苜蓿萌發(fā)期（A）和幼苗期（B）NR活性的影響Fig.1 Effect of NO on NR activity in alfalfa during seed germination（A）and seedling（B）stage under PEG stress

2.1.2 NO對PEG脅迫下紫花苜蓿GS活性的影響 從圖2A可知，紫花苜蓿種子萌發(fā)期GS活性隨時間推移先升高后降低，且第4天時各處理GS活性最大，其中，第4天時，PEG+SNP較PEG處理的GS活性顯著升高了25.38%，PEG+c-PTIO與PEG處理差異不顯著；在正常條件下，SNP處理與CK相比GS活性升高了8.27%，而c-PTIO處理則降低了5.70%。

圖2 NO對PEG脅迫下紫花苜蓿萌發(fā)期（A）和幼苗期（B）GS活性的影響Fig.2 Effect of NO on GS activity in alfalfa during seed germination（A）and seedling（B）stage under PEG stress

在紫花苜蓿幼苗葉片中，GS活性變化趨勢與萌發(fā)期一致（圖2B）。正常供水及PEG脅迫下外源施加SNP均可明顯增加紫花苜蓿幼苗中GS活性，且在第4天時效果最為顯著，PEG+SNP處理較PEG處理的GS活性升高了23.56%，SNP處理與CK相比GS活性升高了3.32%。施加c-PTIO與CK在第2、4、6天無顯著差異，在第8天時起顯著的抑制作用，此時，PEG+c-PTIO比PEG處理的GS活性降低了3.06%。c-PTIO處理和CK相比GS活性降低了21.99%。

2.1.3 NO對PEG脅迫下紫花苜蓿GOGAT活性的影響 紫花苜蓿種子萌發(fā)期GOGAT活性呈先升高后降低的趨勢，處理第4天時，GOGAT活性達到最大值。PEG脅迫抑制GOGAT活性，而PEG+SNP會使GOGAT活性不同程度的上升。PEG+SNP處理較PEG處理GOGAT活性在第2、4、6、8天分別升高了45.93%、42.12%、39.03%和60.06%。而NO清除劑c-PTIO在第2天時沒有表現出抑制作用，但在第4、6、8天均抑制GOGAT活 性。第8天 時，c-PTIO處理 與CK相比GOGAT活性 降 低 了16.15%；PEG+c-PTIO較PEG處 理 相比GOGAT活性降低了22.19%（圖3A）。

圖3 NO對PEG脅迫下紫花苜蓿萌發(fā)期（A）和幼苗期（B）GOGAT活性的影響Fig.3 Effect of NO on GOGAT activity in alfalfa during seed germination（A）and seedling（B）stage under PEG stress

與萌發(fā)期相反，紫花苜蓿幼苗期GOGAT活性變化為先下降再上升，但同一時間各處理間GOGAT活性變化與萌發(fā)期一致。在第8天幼苗葉片中GOGAT活性最高，PEG+SNP與PEG處理相比GOGAT活性升高了23.08%。在第2、4、6天，正常及PEG脅迫下施用c-PTIO與CK及PEG相比，對GOGAT活性抑制效果均不穩(wěn)定；第8天時，c-PTIO與CK相比GOGAT活性降低了15.75%；PEG+c-PTIO較PEG處理相比GOGAT活性降低了8.59%（圖3B）。

2.1.4 NO對PEG脅迫下紫花苜蓿GDH活性的影響 紫花苜蓿種子萌發(fā)期GDH活性呈先升高后降低的趨勢，且在第6天時各處理GDH活性達最大值。與CK相比，PEG處理使GDH活性增加，而PEG+SNP較PEG處理GDH活性均降低，第2、4、6、8天GDH活性分別降低了17.52%、12.75%、21.48%和35.89%。NO抑制劑c-PTIO在整個萌發(fā)過程中均起促進作用，c-PTIO處理與CK相比GDH活性平均增加了28.29%；PEG+c-PTIO與PEG處理相比GDH活性平均提高了18.26%（圖4A）。

圖4 NO對PEG脅迫下紫花苜蓿萌發(fā)期（A）和幼苗期（B）GDH活性的影響Fig.4 Effect of NO on GDH activity in alfalfa during seed germination（A）and seedling（B）stage under PEG stress

紫花苜蓿幼苗期GDH活性變化為先下降后上升。在第8天時GDH活性升到最高值，且各處理間呈現顯著差異，PEG處理與CK相比GDH活性升高了39.15%，而PEG+SNP較PEG處理GDH活性降低了34.86%。正常條件下噴施c-PTIO與CK相比GDH活性增加了39.28%，PEG+c-PTIO較PEG處理相比GDH活性增加了13.70%（圖4B）。

2.2 NO對PEG脅迫下紫花苜蓿游離氨基酸總量的影響

紫花苜蓿種子萌發(fā)期氨基態(tài)氮含量隨脅迫時間增加逐漸上升。在第2、4、6、8天，紫花苜蓿萌發(fā)期種子中氨基態(tài)氮含量在PEG+SNP下比PEG處理分別降低了26.66%、5.77%、11.85%、15.38%；PEG+c-PTIO較PEG處理在第2、6、8天分別降低了22.00%、7.85%、18.02%，第4天增加了1.75%。在正常情況下，外源施加SNP及c-PTIO均促進氨基態(tài)氮的積累（圖5A）。

苜蓿幼苗葉片中氨基態(tài)氮含量也隨著處理時間延長逐漸增加。第4天時，葉片中游離氨基酸含量PEG+SNP較PEG處理顯著降低了11.36%，PEG+c-PTIO較PEG處理顯著增加了13.11%。而在第6、8天時，施加SNP對氨基態(tài)氮含量無顯著影響。與CK相比，正常情況下添加c-PTIO，葉片中氨基態(tài)氮含量在第4天和6天均顯著升高（圖5B）。

圖5 NO對PEG脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)期（A）及幼苗期（B）氨基態(tài)氮含量的影響Fig.5 Effect of NO on amino nitrogen content of alfalfa during seed germination（A）and seedling（B）stage under PEG

2.3 NO對PEG脅迫下紫花苜?？偟鞍缀康挠绊?/h3>

紫花苜蓿種子萌發(fā)期總蛋白含量隨著處理時間延長呈下降的趨勢。PEG+SNP較PEG處理在第2、4、6天提高了紫花苜蓿種子總蛋白含量，且在第4天時提高幅度最大，為59.36%；但在第8天時呈抑制作用，紫花苜蓿種子總蛋白含量降低了36.03%。與CK相比，施加c-PTIO在整個萌發(fā)過程中均起抑制作用。如圖6B所示，幼苗期紫花苜蓿葉片內的總蛋白水平隨脅迫天數的增加而提高。PEG+SNP較PEG處理紫花苜蓿幼苗葉片的總蛋白含量差異不顯著，PEG+c-PTIO較PEG處理葉片中總蛋白含量在第8天顯著降低（圖6）。

圖6 NO對PEG脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)期（A）及幼苗期（B）總蛋白含量的影響Fig.6 Effect of NO on total protein content of alfalfa during seed germination（A）and seedling（B）stage under PEG

2.4 NO對PEG脅迫下紫花苜蓿可溶性蛋白含量的影響

紫花苜蓿萌發(fā)種子中可溶性蛋白含量隨處理時間推移逐漸下降。與PEG處理相比，第2天PEG+SNP與PEG+c-PTIO處理可溶性蛋白含量分別顯著提高了33.60%和18.55%，第4、6天差異不顯著；第8天，PEG+SNP處理下顯著增加了43.12%，PEG+c-PTIO處理影響不顯著。與CK相比，SNP處理顯著提高了第2天可溶性蛋白含量，第4、6、8天差異不顯著；c-PTIO處理顯著降低了第4天可溶性蛋白含量，其他天數無顯著影響（圖7A）。

圖7 NO對PEG脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)期（A）及幼苗期（B）可溶性蛋白含量的影響Fig.7 Effect of NO on soluble protein content of alfalfa during seed germination（A）and seedling（B）stage under PEG

與萌發(fā)期相同，紫花苜蓿葉片中可溶性蛋白含量隨處理時間延長逐漸降低（圖7B）。PEG+SNP較PEG處理在第2、4、8天可溶性蛋白含量分別顯著升高了19.11%、26.58%和17.47%，PEG+c-PTIO較PEG處理僅在第2天差異顯著。非脅迫下，SNP處理和c-PTIO處理與CK對葉片可溶性蛋白含量無顯著影響。

2.5 NO對PEG脅迫下紫花苜?？扇苄缘鞍譙DS－PAGE圖譜的研究

萌發(fā)期紫花苜蓿幼芽中可溶性蛋白SDS－PAGE電泳如圖8A所示，在處理第2天時，蛋白電泳條帶數多達12條，且分子量為97.4與47.0 kDa的蛋白含量最多。與處理第2天相比，在第4天分子量為97.4 kDa的蛋白表達量降低，除PEG+c-PTIO處理，分子量為47.0 kDa的蛋白表達量增加；在第6和8天，分子量97.4 kDa的蛋白不表達，且47.0 kDa的蛋白表達量降低。此外，在第4天，與CK相比，PEG和PEG+SNP處理下分子量介于14.4～22.0 kDa的蛋白表達量增加，c-PTIO與PEG+c-PTIO處理下產生了分子量為43.0 kDa的新蛋白條帶。

從紫花苜蓿幼苗葉片可溶性蛋白SDS－PAGE電泳圖譜（圖8B）可以看出，紫花苜蓿幼苗葉片可溶性蛋白只有蛋白質亞基分子量分別為47.0與14.4 kDa的2條電泳條帶，且蛋白表達量隨時間延長逐漸增加。在同一處理時間，PEG處理較CK增加了47.0 kDa蛋白的表達量；與PEG處理相比，PEG+SNP處理對分子量為47.0 kDa的蛋白表達量影響不大，PEG+c-PTIO降低了其表達量。

圖8 PEG脅迫下外施NO對紫花苜蓿種子萌發(fā)期（A）及幼苗期（B）可溶性蛋白電泳圖譜的影響Fig.8 Effects of NO on soluble protein electrophoresis atlas in alfalfa during seed germination（A）and seedling（B）stage under PEG stress

3 討論與結論

干旱脅迫下植物生長受到抑制是最明顯的形態(tài)特征。本課題組前期研究結果表明，干旱脅迫抑制了紫花苜蓿種子的萌發(fā)與幼苗的生物量，而施加外源NO則對該抑制作用具有顯著的緩解作用，這與NO改變植物體內生理代謝過程有關［26］。氮代謝是影響植物生長最基本的生理過程之一［27－29］，它通過氮吸收、同化及有機含氮化合物合成等方面調節(jié)植物的抗逆性［30］。NR是影響氮代謝速率的關鍵酶，可以將植物從土壤吸收的NO3－在細胞質中還原為NO2－，然后在葉綠體中經亞硝酸還原酶還原為NH4+［31］。本研究中，PEG脅迫下NR活性在萌發(fā)期及幼苗期均降低，外源施加SNP顯著提高了NR活性，這說明NO促進了干旱下苜蓿對NO3－的同化。NR活性越高植物體內NO3－同化能力越強［32］，且植物體內的硝態(tài)氮轉化為銨態(tài)氮引導著作物對氮肥的吸收和利用［33－34］。

GS－GOGAT循環(huán)可將光呼吸產生的NH4+轉變?yōu)榘被幔?5］，此途徑中，NH4+首先與谷氨酸在GS的催化作用下合成谷氨酰胺（glutamine，Gln），隨后Gln和α-酮戊二酸在GOGAT的催化作用下形成兩分子谷氨酸［36］。其中一分子谷氨酸用于合成其他氨基酸和酰胺，形成可被植物直接利用的氮素化合物；另一分子則作為原料再次進入GS－GOGAT循環(huán)中［37］。植物中的GDH是存在于線粒體中的應激反應酶［38］，以NADH為輔酶在逆境中行使NH4+同化的功能［39］。GDH催化NH4+和α-酮戊二酸縮合形成谷氨酸，且該過程是可逆的。當植物在逆境時，GS和GOAT活性被抑制，NO3－同化和蛋白質降解產生的NH4+積累引起氨中毒，此時，GDH活性增加，在誘導脅迫保護分子合成［40］及解除氨中毒方面發(fā)揮了獨特作用［41］。在本研究中，在PEG脅迫下紫花苜蓿萌發(fā)期及幼苗期GS和GOGAT活性都降低，GDH活性升高，說明干旱脅迫下紫花苜蓿生長受到抑制是由NH4+中毒引起的，而PEG+SNP處理增加了紫花苜蓿GS與GOGAT的活性，GDH活性下降，緩解了干旱下NH4+的過量積累。此外，GS、GOGAT和GDH作為NH4+同化過程關鍵酶，還與脯氨酸等滲透調節(jié)物質合成密切相關，維持水分平衡［42］。周萬海等［43］發(fā)現，鹽脅迫下紫花苜蓿NR、GS和GOGAT活性降低，外施NO緩解了鹽脅迫對NR、GS和GOGAT活性的抑制作用。本研究中，PEG脅迫下紫花苜蓿萌發(fā)期種子及幼苗葉片中NR、GS和GOGAT活性降低，而PEG+SNP處理增加了NR、GS和GOGAT活性，這說明干旱下施加外源NO促進了紫花苜蓿對氮素的吸收同化。施加c-PTIO抑制了紫花苜蓿中NR、GS、GOGAT的活性，提高了GDH活性。因此，干旱脅迫下內源NO也參與了紫花苜蓿的氮素轉運。相同處理下，外源SNP對紫花苜蓿苗期葉片中NR、GS、GDH活性的提高幅度遠大于種子萌發(fā)期，說明NO對葉片氮素代謝酶的影響要大于根系。

植物吸收的無機態(tài)氮在植物體內大多數形成氨基酸，進一步合成蛋白質，少部分參與核酸等含氮物質的代謝。氨基酸和蛋白質作為植物氮代謝的主要產物，其含量直接影響著植物的生長進程、生物量及品質［44］。本研究發(fā)現，PEG脅迫下紫花苜蓿中游離氨基酸總量增加，蛋白質含量降低，說明干旱引起蛋白質合成受阻，而PEG脅迫下外施SNP可使游離氨基酸的含量不同程度降低，蛋白質含量可以不同程度的提高，促進游離氨基酸向合成蛋白質的方向轉運。這與邵瑞鑫等［45］以及魏小紅等［46］的研究一致。也有研究表明，水分脅迫下作物體內游離氨基酸增加，尤其是游離脯氨酸含量明顯增加是由于蛋白質水解占優(yōu)勢，使可溶性蛋白質含量下降［47］。本研究中，干旱脅迫下可溶性蛋白含量降低，外施SNP其含量增加，這是因為NO抑制了蛋白質的降解。高濃度游離氨基酸有助于植物抵御逆境，高水平可溶性蛋白含量有利于細胞正常發(fā)揮功能。此外，干旱及NO引起蛋白質的組分發(fā)生變化，這些外界信號的感知與轉導調節(jié)基因的表達，產生新的蛋白，從而引起生理代謝的變化［48］。

綜上所述，PEG模擬的干旱脅迫使紫花苜蓿氮代謝紊亂，而干旱下施加外源NO供體（SNP）處理通過調節(jié)氮代謝關鍵酶活性介導紫花苜蓿萌發(fā)期及幼苗期葉片氮代謝，緩解了干旱脅迫NH4+對紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗的傷害。此外，游離氨基酸與可溶性蛋白含量增加，提高了紫花苜蓿的滲透調節(jié)能力使其含水量增加［26］。因此，NO通過調節(jié)紫花苜蓿氮代謝過程來提高其抗旱性。