王寧 周金旭 徐浩 王秀利

摘 要：為深入了解簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeats，SSR）分子標(biāo)記在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用情況，為今后開展水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的分子標(biāo)記輔助育種，綜述了SSR的開發(fā)方法以及SSR在種群的遺傳多樣性分析、數(shù)量性狀的定位、DNA指紋圖譜構(gòu)建、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面的研究進(jìn)展。SSR分子標(biāo)記在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的種質(zhì)鑒定、遺傳距離分析、分子標(biāo)記輔助育種等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：SSR;分子標(biāo)記;水產(chǎn)養(yǎng)殖

SSR即簡(jiǎn)單重復(fù)序列，也稱作微衛(wèi)星DNA （ Microsatellite DNA）或是短串聯(lián)重復(fù)序列 （Short tandem repeats）[1]。因?yàn)镾SR具有豐富的多態(tài)性，使其成為繼單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）之后最有用的用于遺傳研究的DNA標(biāo)記之一[2]?，F(xiàn)階段已經(jīng)開發(fā)多種分子標(biāo)記手段[3]，如單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（SNP）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA標(biāo)記（Random amplified polymorphic，RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）和微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR）等，且已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物遺傳研究中[4-8]。SSR具有其他分子標(biāo)記不可比擬的優(yōu)勢(shì)[9]，使其在動(dòng)物分子標(biāo)記育種中具有很高的研究和應(yīng)用潛力。近年來(lái)， SSR標(biāo)記技術(shù)作為重要的分子標(biāo)記育種技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中[10-12]。本文對(duì)SSR在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的研究和應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 SSR簡(jiǎn)介

1.1 SSR的定義

SSR是指含極短單位（通常小于10 bp）串聯(lián)重復(fù)序列的基因組DNA片段，通常重復(fù)相對(duì)較少的次數(shù)，以不同的長(zhǎng)度散布在真核生物基因組中[1]。SSR標(biāo)記技術(shù)是基于特定引物PCR擴(kuò)增的一項(xiàng)分子標(biāo)記技術(shù)，屬于第二代分子標(biāo)記技術(shù)，由Litt和Luty最早在1989年研究心肌肌動(dòng)蛋白基因時(shí)提出[13]。其通常由1～6 bp串聯(lián)重復(fù)的核苷酸為核心序列，例如（AC）n、（GT）n、（AT）n和（ATT）n等，n為核心序列的重復(fù)次數(shù)，一般為10～60次不等。由于其核心序列的重復(fù)次數(shù)不同和核心序列不完全相同，使SSR具有豐富的多態(tài)性。因?yàn)镾SR兩端的單拷貝序列具有保守性，所以可根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則設(shè)計(jì)出特異性引物，運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)含有SSR的基因組DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的目的片段可通過電泳等方式分析其多態(tài)性[14-16]。

1.2 SSR的優(yōu)缺點(diǎn)

鑒于前文所述SSR的構(gòu)成特點(diǎn)，SSR作為標(biāo)記技術(shù)在開發(fā)和利用中展現(xiàn)出明顯的優(yōu)缺點(diǎn)。SSR的優(yōu)點(diǎn)在于：（1）呈孟德爾共顯性遺傳，不易被選擇淘汰掉。（2）隨機(jī)散布在真核生物的基因組中，數(shù)量豐富。如Beckman等[17]研究發(fā)現(xiàn)人類基因組中大約每6 kb就存在一個(gè)SSR位點(diǎn)，且SSR既存在于編碼區(qū)也存在于非編碼區(qū)。 （3）高效，只需少量DNA就可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析鑒定分析[18]。（4）其核心序列種類多，重復(fù)程度多樣，使其具有高度的多態(tài)性。（5）種屬間部分物種可以共用，具有良好的通用性。如楊璞等[19]用蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）的SSR引物在櫛孔扇貝（Chlamys farreri）的基因組DNA上擴(kuò)增出了相應(yīng)的SSR位點(diǎn)。（6）不同的SSR位點(diǎn)由不同的引物序列決定，有利于更高效、更優(yōu)化的引物開發(fā)。

然而現(xiàn)階段SSR在使用過程中也會(huì)展現(xiàn)出一些缺陷：對(duì)于基因序列完全未知的物種而言，SSR位點(diǎn)引物開發(fā)是一大難點(diǎn)，這需要構(gòu)建基因組文庫(kù)或者全基因組測(cè)序，需要花費(fèi)大量的物力、人力以及時(shí)間;SSR位點(diǎn)會(huì)存在一些突變，比如起始位點(diǎn)的DNA會(huì)發(fā)生替代，插入和缺失導(dǎo)致非等位基因的出現(xiàn)[20];SSR多態(tài)性檢測(cè)依賴PCR擴(kuò)增效果，PCR擴(kuò)增效果的好壞會(huì)受諸多因素影響，例如引物3`端的堿基發(fā)生突變會(huì)嚴(yán)重影響PCR的擴(kuò)增效率[21]。為了避免這些問題的發(fā)生，研究者在實(shí)驗(yàn)過程中必須采取嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)手段以開發(fā)更加經(jīng)濟(jì)高效的SSR引物。

2 SSR的開發(fā)方法

目前，已經(jīng)建立了多種SSR開發(fā)方法，包括構(gòu)建基因組文庫(kù)篩選法[22]、濾膜富集法[23]、磁珠富集法[24]、基于PCR技術(shù)開發(fā)SSR標(biāo)記法[25]、數(shù)據(jù)庫(kù)篩選法[26]以及基于高通量技術(shù)開發(fā)SSR標(biāo)記[27]等方法。構(gòu)建基因文庫(kù)篩選法是通過提取、分離、純化得到DNA片段，連接載體后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中構(gòu)建基因組文庫(kù)，利用放射性同位素或其他發(fā)光化學(xué)物質(zhì)標(biāo)記的SSR探針與基因組文庫(kù)中的DNA雜交，對(duì)陽(yáng)性克隆結(jié)果進(jìn)行測(cè)序并設(shè)計(jì)SSR引物[22]。此方法雖然工作量大，但是操作流程簡(jiǎn)單，是最經(jīng)典的傳統(tǒng)方法。濾膜富集法和磁珠富集法是基于基因文庫(kù)篩選法的基礎(chǔ)上開發(fā)的新方法，他們都是在構(gòu)建基因文庫(kù)之前利用SSR探針將基因組文庫(kù)DNA片段進(jìn)行富集，以此來(lái)提高陽(yáng)性克隆的獲得率。但是這兩種方法依然需要構(gòu)建基因組文庫(kù)，操作過程較復(fù)雜?；赑CR技術(shù)開發(fā)的方法避免了構(gòu)建基因文庫(kù)，但是技術(shù)要求高，實(shí)驗(yàn)條件苛刻，實(shí)際應(yīng)用較為困難。數(shù)據(jù)庫(kù)篩選法就是利用核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)查詢已公布的SSR標(biāo)記，同樣避免基因組文庫(kù)的構(gòu)建，利用數(shù)據(jù)庫(kù)獲得SSR標(biāo)記方便又快捷，但是篩選出的SSR標(biāo)記多態(tài)性不如構(gòu)建基因文庫(kù)方法篩選出的SSR標(biāo)記多態(tài)性好。高通量測(cè)序技術(shù)，即下一代測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)可同時(shí)對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序，其效率要遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序法[28]。如岳華梅等[29]采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)興國(guó)紅鯉（Cyprinus carpio var.singuonensis）垂體和性腺等組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選出了多態(tài)性較好的9個(gè)SSR標(biāo)記。這9個(gè)SSR位點(diǎn)可能與功能基因相關(guān)，從而可為后續(xù)遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位等提供有力支持。上述的SSR標(biāo)記開發(fā)方法各有自己的優(yōu)勢(shì)和不足，在研究中可根據(jù)自己的目的和狀況來(lái)選擇最適合自身的SSR標(biāo)記的開發(fā)方法。

3 SSR在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的應(yīng)用

3.1 種群的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是指地球上所有生物所攜帶的遺傳信息的總和。但一般實(shí)驗(yàn)研究的是種內(nèi)的遺傳多樣性，即種內(nèi)個(gè)體之間或種群內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異總和。分析某一野生群體的遺傳多樣性，有助于對(duì)該種群種質(zhì)資源的評(píng)估，對(duì)于以后作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物引進(jìn)和培養(yǎng)具有重要的指導(dǎo)意義。對(duì)于養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析，能夠?qū)ζ浞N質(zhì)資源進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)是否發(fā)生種質(zhì)資源退化，從而通過引進(jìn)優(yōu)良原種等方式改善該養(yǎng)殖區(qū)域的養(yǎng)殖狀況。遺傳多樣性是組成生物多樣性的重要部分，SSR作為重要的分子標(biāo)記，可用于檢測(cè)個(gè)體基因型，統(tǒng)計(jì)群體的等位基因數(shù)目和頻率，并利用分子遺傳學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，計(jì)算種群的遺傳變異程度，初步評(píng)價(jià)種群的遺傳多樣性[30]。

近年來(lái)，SSR分子標(biāo)記已經(jīng)在多種水產(chǎn)動(dòng)物的群體遺傳多樣性研究中發(fā)揮了重要作用。如慎佩晶等[31]對(duì)來(lái)自以色列、緬甸、孟加拉、核心種（南太湖2號(hào)）和泰國(guó)的5個(gè)羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）群體中的127個(gè)樣品進(jìn)行了遺傳多樣性分析，共檢測(cè)出70個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。并利用這些SSR作為分子標(biāo)記，經(jīng)統(tǒng)計(jì)和遺傳分析得出這些群體的遺傳相似數(shù)在0.367 4～0.796 5之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.554 1;親緣關(guān)系最近的兩群體為孟加拉群體和核心群體，其相似系數(shù)為0.796 5，而以色列和孟加拉這兩個(gè)群體的相似系數(shù)為0.367 4，親緣關(guān)系也最遠(yuǎn)?？傮w而言實(shí)驗(yàn)的所有種群的遺傳多樣性都比較高，為以后羅氏沼蝦的雜交育種提供了理論依據(jù)。譚云飛等[32]運(yùn)用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)我國(guó)長(zhǎng)江中下游流域的13個(gè)克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）野生群體進(jìn)行了遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，對(duì)其等位基因數(shù)（Na）、期望雜合度（He）、觀測(cè)雜合度（Ho）、多態(tài)性信息含量（PIC）、Hardy-Weinberg平衡指數(shù)與遺傳距離等做了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦在我國(guó)已初步形成3個(gè)不同的遺傳群體，有向不同遺傳群體分化的趨勢(shì)，并建議要做好這3個(gè)種群的保種工作，防止發(fā)生種質(zhì)退化。趙彥花等[33]對(duì)珠江口海域的黃唇魚（Bahaba flavolabiata） 群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，對(duì)黃唇魚的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增開發(fā)，通過毛細(xì)管電泳檢測(cè)（Capillary electrophoresis，CE），并進(jìn)行遺傳分析計(jì)算得出黃唇魚種群遺傳多樣性水平并沒有隨其種群數(shù)量的減少而下降，依然保持較高的水平，為以后的黃唇魚遺傳學(xué)研究提供了初步的分子基礎(chǔ)。Du等[34]為了解日本對(duì)蝦（Penaeus japonicus）種質(zhì)資源現(xiàn)狀，利用形態(tài)計(jì)量學(xué)分析和熒光微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)5個(gè)日本對(duì)蝦群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明雖然這5個(gè)種群都具有較高的遺傳多樣性，但是地理距離越近的種群，其相似性越高。該結(jié)果意味著棲息地條件、環(huán)境條件和人類活動(dòng)可能是造成日本對(duì)蝦種群遺傳變異的主要原因。通過遺傳多樣性分析可了解種群的遺傳結(jié)構(gòu)、生活狀況和分析進(jìn)化歷程，才能提出合理的保護(hù)措施。綜合上述研究實(shí)例可見，SSR作為理想的遺傳標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用到水產(chǎn)動(dòng)物遺傳多樣性研究中，推動(dòng)了保種工作的進(jìn)展。

3.2 數(shù)量性狀的定位

數(shù)量性狀的定位是指分析某一數(shù)量性狀與染色體上某一DNA標(biāo)記的關(guān)系，從而估計(jì)遺傳效應(yīng)[35]。因SSR具有極高的穩(wěn)定性，使其成為能被利用進(jìn)行數(shù)量性狀定位的重要分子標(biāo)記之一。對(duì)于數(shù)量性狀的定位有助于優(yōu)良性狀的篩選，選擇優(yōu)勢(shì)性狀的個(gè)體或群體進(jìn)行培養(yǎng)，能夠提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益，從而保護(hù)優(yōu)秀的種質(zhì)資源。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究利用SSR作為分子標(biāo)記對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖物種進(jìn)行了性狀關(guān)聯(lián)分析。袁文成等[36]采用高通量測(cè)序法，從翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）的轉(zhuǎn)錄組中篩選得到13對(duì)EST-SSR（Expression Sequence Target SSR）引物，對(duì)體長(zhǎng)、體高、體厚及體重4種生長(zhǎng)性狀進(jìn)行標(biāo)記性狀相關(guān)性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記與生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)。該研究為翹嘴鱖的種質(zhì)資源保護(hù)以及分子輔助標(biāo)記育種提供分子機(jī)制上的依據(jù)。王丹等[37]通過對(duì)鰱（Hypophthalmichthys molitrix）的卵組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選出36個(gè)條多態(tài)性高的EST-SSR標(biāo)記，其中兩個(gè)位點(diǎn)（SCE26和SCE65）與生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)。在全同胞家系中的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，SCE26與鰱的體長(zhǎng)和體重顯著相關(guān)，而SCE65與鰱的肥滿度顯著相關(guān)。該研究為鰱的生長(zhǎng)性狀相關(guān)的基因鑒定提供幫助，為分子標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)的理論指導(dǎo)。由上述研究實(shí)例可以看出，SSR標(biāo)記進(jìn)行數(shù)量性狀定位已經(jīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮了重要作用。伴隨著第二代測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用和價(jià)格的持續(xù)走低，SSR標(biāo)記的開發(fā)越發(fā)簡(jiǎn)單，以SSR為分子標(biāo)記的生長(zhǎng)性狀相關(guān)的研究將在水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

3.3 DNA指紋圖譜構(gòu)建

Jefferys等[38]將人源小衛(wèi)星DNA作為基因探針，與人體核DNA酶切片段雜交，得到由多個(gè)位點(diǎn)等位基因組成的長(zhǎng)度不一的雜交帶圖紋，此圖紋類似指紋，極少有兩個(gè)人完全相同，所以稱作DNA指紋（DNA fingerprint），多個(gè)DNA指紋組成DNA指紋圖譜（DNA finger print）。DNA指紋圖譜有多位點(diǎn)性、高變異性、遺傳穩(wěn)定的特點(diǎn)，可用于個(gè)體的鑒定、親子關(guān)系鑒定以及檢測(cè)目標(biāo)基因組的變化。

鑒于DNA指紋圖譜的上述優(yōu)點(diǎn)，研究者們已將此項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中種質(zhì)資源鑒定和物種區(qū)分，并取得了多項(xiàng)研究成果。廖梅杰等[39]采用指紋圖譜技術(shù)對(duì)中國(guó)青島、煙臺(tái)，韓國(guó)浦項(xiàng)、群山、木浦，俄羅斯符拉迪沃斯托克的刺參（Apostichopus japonicus）群體進(jìn)行了指紋圖譜構(gòu)建。其研究中篩選出的13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)特異性較高，能夠把8個(gè)實(shí)驗(yàn)群體一一區(qū)分開來(lái)，為以后刺參的種質(zhì)資源鑒定提供了數(shù)據(jù)支撐。王成龍等[40]為了在草魚（Ctenopharyngodon idellus）雌核發(fā)育后代的群體中區(qū)分出雌核發(fā)育草魚以及團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）和草魚的雜交后代，構(gòu)建了由14個(gè)SSR標(biāo)記組成的3個(gè)草魚群體的DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建DNA指紋圖譜。此圖譜可以簡(jiǎn)單、高效地區(qū)分出雌核發(fā)育的草魚個(gè)體和草魴雜交個(gè)體。我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，水產(chǎn)物種種群具有多樣性，DNA指紋圖譜的構(gòu)建將會(huì)指導(dǎo)種群種質(zhì)資源的鑒定和挖掘，進(jìn)而促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展。

3.4 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

遺傳連鎖圖譜是指某一物種已知基因或遺傳標(biāo)記在染色體上的相對(duì)位置。遺傳作圖（Genetic mapping）即遺傳圖譜的構(gòu)建，是利用遺傳學(xué)原理和方法，構(gòu)建能反映基因組中遺傳標(biāo)記之間遺傳關(guān)系的圖譜。SSR分子標(biāo)記因其上述特點(diǎn)成為構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的重要分子標(biāo)記。因?yàn)檫z傳連鎖圖譜的制作有利于水產(chǎn)動(dòng)物功能基因和優(yōu)良性狀的深入研究，眾多的研究利用SSR標(biāo)記在多個(gè)水產(chǎn)物種中構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，并在水產(chǎn)養(yǎng)殖中進(jìn)行了廣泛的應(yīng)用。

趙永偉等[41]以半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）的全同胞家系為作圖群體，構(gòu)建了其雌、雄的SSR標(biāo)記遺傳連鎖圖譜。他們構(gòu)建的連鎖圖的覆蓋率各為83.3%和82%，其質(zhì)量已達(dá)中等水平，可一定程度上指導(dǎo)半滑舌鰨的遺傳育種工作。龐仁誼等[42]通過SSR標(biāo)記對(duì)牙鲆（Paralichthysolivaceus）遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，相比于宋文濤等[43]國(guó)內(nèi)構(gòu)建的牙鲆第一張遺傳連鎖圖譜有更高的覆蓋率，且標(biāo)記數(shù)也有所增加，使得圖譜的質(zhì)量、可信度和實(shí)際使用價(jià)值都得到了相應(yīng)的提高，該圖譜進(jìn)一步推動(dòng)了牙鲆的遺傳育種工作。Guo等[44]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了鰱（Hypophthalmichehys molitrix）的第二代遺傳連鎖圖譜，該遺傳連鎖圖譜覆蓋率明顯提升，達(dá)到了93.1%，為鰱的數(shù)量性狀基因的定位、比較基因組學(xué)和標(biāo)記輔助選擇等研究提供了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

4 結(jié)語(yǔ)

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是我國(guó)重要的支柱產(chǎn)業(yè)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康、優(yōu)質(zhì)、可持續(xù)發(fā)展離不開現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的支持。分子標(biāo)記輔助育種作為重要的科學(xué)育種手段，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中。SSR標(biāo)記技術(shù)因?yàn)槠渥陨淼膬?yōu)勢(shì)，能夠?qū)︷B(yǎng)殖群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，為保護(hù)種質(zhì)資源提供重要的指導(dǎo);對(duì)數(shù)量性狀進(jìn)行定位和分析，篩選出具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的基因型，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益;制作覆蓋率高的遺傳連鎖圖譜，為以后的育種和養(yǎng)殖提供遺傳學(xué)基礎(chǔ);制作DNA指紋圖譜，能夠在混養(yǎng)的大型養(yǎng)殖環(huán)境中，避免近親交配所帶來(lái)的種質(zhì)退化、生長(zhǎng)個(gè)體變小、生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)消失等現(xiàn)象。隨著生物信息技術(shù)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，SSR標(biāo)記的開發(fā)和利用將會(huì)不斷深入，使其在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Abstract：In order to understand the application of simple sequence repeats （SSR） molecular markers in aquaculture and to develop marker-assisted breeding for aquaculture animals in the future， the research progress of the development methods of SSR， genetic diversity analysis in breed population， quantitative trait mapping， DNA fingerprinting and genetic linkage map construction by using SSR were reviewed. SSR molecular markers have broad application prospects in germplasm identification， genetic distance analysis and molecular marker-assisted breeding of aquaculture animals.

Key words：SSR; molecular markers; aquaculture

（收稿日期：2021-07-13）