陳 佳，柯巧珍，余訓(xùn)凱，張文兵，黃匡南，翁華松，包欣源，劉興彪，劉家富*

（1.大黃魚育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司，福建寧德 352103；2.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東青島 266071）

大黃魚（Larimichthys crocea）是目前我國養(yǎng)殖規(guī)模最大的海水魚類，2019年養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)22.55×104t，年育苗量達(dá)34.16億尾［1］。在以往大黃魚育苗過程中，由于仔稚魚期大黃魚苗尚未或少量攝食人工顆粒飼料，育苗戶時(shí)常往育苗池潑灑魚用電解多維（魚用多種維生素預(yù)混合料），以保障仔稚魚對各種維生素的正常需求。魚用電解多維富含大黃魚苗生長發(fā)育所必需的多種維生素，但育苗場施用電解多維后，大黃魚仔稚魚發(fā)育畸形現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，且目前未見相關(guān)研究報(bào)道。2014年至今，寧德市多家育苗場培育的大黃魚仔稚魚出現(xiàn)尾部發(fā)育畸形，對生產(chǎn)造成重大損失。因此，本研究初步探討電解多維對大黃魚仔稚魚尾部骨骼發(fā)育致畸性原理，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果為指導(dǎo)生產(chǎn)中電解多維的最佳使用策略提供基礎(chǔ)資料，進(jìn)而指導(dǎo)大黃魚苗種安全生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)條件與材料

實(shí)驗(yàn)用魚卵：閩-粵東族大黃魚受精卵。

養(yǎng)殖設(shè)施：100 m3育苗池（長×寬×深＝10 m×5 m×2 m）。

實(shí)驗(yàn)用水：過濾海水充分曝氣，鹽度23～24，水溫維持在（25±0.5）℃，pH為7.8～8.2，溶氧量≥5 mg·L－1。

實(shí)驗(yàn)藥劑：電解多維（粉劑）；產(chǎn)品名稱：魚用維生素預(yù)混合飼料（JG352）；生產(chǎn)廠家：湖北省金谷藥業(yè)有限公司；產(chǎn)品批準(zhǔn)文號：鄂飼（預(yù)）字（2014）178131；每千克成分含量：維生素A≥1 200 000 IU，維生素D3≥300 000 IU，維生素E≥4 000 mg，維生素B1≥3 500 mg，維生素B2≥4 000 mg，維生素B6≥3 000 mg，維生素B12≥5 mg，維生素C≥4 000 mg，煙酸≥8 000 mg，葉酸≥500 mg，水分≤10%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

設(shè)置實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3和對照組，每組2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)在單口100 m3育苗池中放入3 kg大黃魚受精卵，進(jìn)行正常的受精卵孵化和苗種培育操作。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，各組選擇以孵化后3 d（初孵仔魚開口期）或20 d（稚魚初始期）為電解多維浸泡或投喂起始時(shí)間。實(shí)驗(yàn)組1潑灑電解多維的起止時(shí)間為受精卵孵化后的第3～10 d，電解多維濃度5.0 mg·L－1；實(shí)驗(yàn)組2潑灑電解多維的起止時(shí)間為受精卵孵化后的第20～27 d，電解多維濃度5.0 mg·L－1；實(shí)驗(yàn)組3拌料投喂電解多維起止時(shí)間為受精卵孵化后的第20～27 d，電解多維每天投入量占仔稚魚體質(zhì)量的比重為30 mg·kg－1；對照組不潑灑也不拌料投喂電解多維。

實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，每口育苗池中分別加入增溫海水，保持曝氣，根據(jù)大黃魚消化系統(tǒng)發(fā)育情況，3～19 d以輪蟲、豐年蟲和橈足類飽食投喂魚苗，20 d后以人工微顆粒飼料飽食投喂魚苗。每24 h更換等電解多維濃度的實(shí)驗(yàn)用水一次，顯微鏡下觀測并記錄大黃魚仔稚魚尾柄發(fā)育情況，及時(shí)撈除死亡個(gè)體。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

利用Olympus公司CX31型數(shù)碼顯微鏡和尼康圖像軟件開展圖像采集，并分析電解多維對大黃魚仔魚期和稚魚期尾部骨骼發(fā)育的影響。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組1、2、3和對照組的仔稚魚3 d時(shí)尾桿骨均呈平直形，尾鰭發(fā)育正常（圖1－A）。

10 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組1的仔魚尾柄全部呈現(xiàn)形狀因子減小、面積減小，其外形表現(xiàn)為尾部骨骼畸形，尾鰭無法發(fā)育，尾部外形趨向于圓形（圖1－B）；10 d后停止?jié)姙㈦娊舛嗑S，14 d、21 d和27 d時(shí)仍觀察到實(shí)驗(yàn)組1仔稚魚的尾柄畸形現(xiàn)象（圖1－C，圖1－D，圖2－A）。表明仔魚期大黃魚對電解多維非常敏感，并發(fā)生明顯的發(fā)育畸變效應(yīng)，且仔魚畸變后表現(xiàn)為不可逆。

實(shí)驗(yàn)組2、3和對照組的仔魚尾鰭3～27 d均正常發(fā)育，21 d和27 d時(shí)尾鰭的尾上骨和尾下骨均清晰可見，尾桿發(fā)育正常（如圖1－D，圖2－B，圖2－C，圖2－D），表明實(shí)驗(yàn)組2和3稚魚期（受精卵孵化20 d后）大黃魚對電解多維不敏感，即無論以浸泡或拌料投喂方式施用電解多維，與對照組大黃魚苗相比，實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3的大黃魚苗未發(fā)生任何畸變。

圖1 孵化后3～21 d實(shí)驗(yàn)組和對照組大黃魚仔稚魚尾部骨骼特征示例Fig.1 Characteristics of caudal skeletons of Larimichthys crocea larvae（3-21 dph）in experimental group and control group

圖2 孵化27 d后實(shí)驗(yàn)組1、2、3和對照組大黃魚仔稚魚尾部骨骼分化發(fā)育情況示例Fig.2 Examples of differentiation and ontogeny in the caudal skeletons of Larimichthys crocea larvae（27 dph）in experimental group and control group

3 討論

3.1 電解多維對大黃魚仔稚魚的致畸性原理分析

在魚類發(fā)育的仔稚魚期，遺傳、營養(yǎng)、水環(huán)境和疾病都是導(dǎo)致骨骼發(fā)育畸形的主要影響因子［2］。魚類的脊索和尾部骨骼是畸形發(fā)生率最高的部位［3］。其中尾部骨骼畸形主要表現(xiàn)為尾上骨、尾下骨分化受抑制，尾椎骨畸形等［4］。在人工培育條件下，可通過篩除表型畸形的親本，從而杜絕遺傳因素造成的畸形；因此環(huán)境和營養(yǎng)因素是仔稚魚骨骼發(fā)育畸形的主要誘因［5－6］。

電解多維中維生素A、D是人和動物生長發(fā)育中所必需的維生素，這兩種維生素同為脂溶性維生素［7］，其進(jìn)入機(jī)體后均在小腸部位被吸收，其中一種維生素過量會打破內(nèi)分泌系統(tǒng)的平衡，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平影響到骨骼礦化相關(guān)蛋白的表達(dá)與活性，影響機(jī)體對其他維生素的吸收利用，在生命周期的前兩周容易發(fā)生將一些成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞的變化，而成骨細(xì)胞的缺失很可能導(dǎo)致了骨骼畸形，最終影響生物的正常骨骼發(fā)育［8］。

維生素A是魚類骨代謝的關(guān)鍵營養(yǎng)因子，其可能影響仔稚魚階段骨骼發(fā)育［9－10］。維生素A的代謝是通過兩組核內(nèi)受體進(jìn)行［11］，這些受體能夠與維生素D受體或過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）形成多聚體功能單元，并與骨化或骨骼代謝相關(guān)基因的DNA結(jié)合區(qū)域結(jié)合，對其進(jìn)行調(diào)控［12］。餌料中添加超劑量的維生素A會打破營養(yǎng)平衡，造成仔魚椎骨融合等骨骼發(fā)育畸形［13－14］。此外，在青鳉（Oryzias latipes）的研究中發(fā)現(xiàn)，視黃酸能夠通過視黃酸受體介導(dǎo)多環(huán)芳香烴受體基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控青鳉骨骼的發(fā)育和形成［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，在對照組大黃魚仔魚期，魚苗通過攝食輪蟲、豐年蟲和橈足類，其骨骼即可正常發(fā)育，這應(yīng)該與輪蟲、豐年蟲和橈足類體內(nèi)含有豐富的維生素A等營養(yǎng)成分有很大的相關(guān)性。同時(shí)，20～27 d大黃魚仔稚魚在接受電解多維5.0 mg·L－1的水體濃度潑灑或每天按占仔稚魚體質(zhì)量比30 mg·kg－1的濃度拌料投喂，均未出現(xiàn)骨骼畸形，這進(jìn)一步說明電解多維誘發(fā)骨骼畸形與大黃魚個(gè)體發(fā)育階段存在關(guān)聯(lián)。

維生素D是維持骨骼中鈣和磷平衡、維護(hù)骨骼完整的物質(zhì)［16］。維生素D能夠通過維生素D結(jié)合蛋白和維生素D受體促進(jìn)各種鈣結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)鈣元素的攝取以保持一定的血鈣含量，進(jìn)而維持骨骼中礦物元素穩(wěn)態(tài)和骨骼礦化［17－18］，能直接參與成骨細(xì)胞的分裂、分化以及礦化作用等過程［19］。歐洲海鱸（Dicentrarchus labrax）幼魚在骨骼形成過程中，對低水平的維生素D含量變化也表現(xiàn)出高度敏感性，幼魚飲食中攝入過量的維生素D（＞27.6 IU·g－1）會引發(fā)2個(gè)骨細(xì)胞分化、成熟的重要因子——骨形態(tài)測定蛋白-4（BMP-4）和類胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的基因表達(dá)不同步，主要是IGF-1受抑制表達(dá)水平低，從而造成骨鈣素表達(dá)低，骨骼礦化程度低［17－18］。維生素D的缺乏和過量添加均會造成海水養(yǎng)殖魚類初孵仔魚脊柱和鰓骨發(fā)育異常［4，20］。本研究中實(shí)驗(yàn)組1的3～10 d大黃魚仔魚骨骼發(fā)育出現(xiàn)畸形，其成因或可從上述維生素D攝入不均衡而造成實(shí)驗(yàn)對象骨細(xì)胞關(guān)鍵分化因子表達(dá)異常的結(jié)果得到啟示。

維生素C是魚類重要的微量營養(yǎng)物質(zhì)之一，它是合成骨膠原的必需成分［21］。維生素C缺乏癥會引起骨骼去礦化，引起仔稚魚骨骼畸形［22］。如在閃光鴨嘴鯰（Pseudoplatystoma coruscans）的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中缺乏維生素C時(shí)，魚的頭部和頜骨的骨骼變形，同時(shí)魚鰭也呈現(xiàn)脆弱性［23］。此外，有研究表明，在缺乏維生素E的情況下，維生素C可以在一定程度上起到補(bǔ)償作用，從而降低大口黑鱸（Micropterus salmoides）骨骼畸形發(fā)生率［24］，但長期高劑量的維生素C也有礙骨細(xì)胞的形成。本研究發(fā)現(xiàn)潑灑5.0 mg·L－1的電解多維能夠造成3～10 d大黃魚仔魚發(fā)育致畸性達(dá)100%，但對于這種骨骼發(fā)育畸形的分子機(jī)制和細(xì)胞分化轉(zhuǎn)化機(jī)制等仍需要進(jìn)一步深入探究，以為以后營養(yǎng)性預(yù)防奠定基礎(chǔ)。

3.2 預(yù)防電解多維對大黃魚仔稚魚致畸的措施

本研究表明，在大黃魚仔稚魚培育過程中，維生素使用過量（濃度5.0 mg·L－1）會對仔魚（1～10 d）骨骼發(fā)育造成嚴(yán)重脅迫，致畸性可達(dá)100%。正常情況下，大黃魚仔魚通過攝食輪蟲和豐年蟲即可正常發(fā)育，無需施用電解多維強(qiáng)化營養(yǎng)，因此，對于仔魚（1～10 d）不建議施用；20 d后使用電解多維對大黃魚稚魚骨骼發(fā)育無顯著影響。此外，對于特定維生素過量造成大黃魚仔稚魚骨骼發(fā)育的影響，需要進(jìn)一步定量研究后，才能用以指導(dǎo)不同苗種培育時(shí)期維生素的正確施用劑量，從而保障大黃魚苗種繁育工作健康發(fā)展。