王瑋棋， 牟美睿， 楊仁杰， 劉海學(xué)

(1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院， 天津 300384； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所， 天津 300191；3.天津農(nóng)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院， 天津 300384)

玉米是我國三大糧食作物之一，產(chǎn)量僅次于水稻和小麥[1]，是重要的糧食經(jīng)濟(jì)作物，也是一種健康的粗糧作物[2]，營養(yǎng)豐富。而在直接食用的過程中大部分營養(yǎng)元素不能被人體直接吸收，蛋白質(zhì)等物質(zhì)利用率較低[3]，需要配合多種酶分解利用。種子作為植物生命的起點(diǎn)[4]，其萌發(fā)過程對作物生長至關(guān)重要。目前在全球種子市場中，每年約有60億歐元的損失來自種子的發(fā)芽損失[5]。徐廣海等[6]研究表明，萌發(fā)過程中代謝活動旺盛，可以提高生物酶活性，從而增強(qiáng)玉米營養(yǎng)價值。Chavan和Kadam[7]發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)可以促進(jìn)玉米的蛋白質(zhì)利用率，同時可以降低玉米的抗?fàn)I養(yǎng)因子水平。種子在萌發(fā)過程中通過吸水激活新陳代謝、轉(zhuǎn)移儲備物質(zhì)、產(chǎn)生能量，從而開始蛋白質(zhì)合成(翻譯)并產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)[9]，并且需要多條代謝途徑配合，如糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)和戊糖磷酸途徑等。種子萌發(fā)的代謝過程對種子活力(發(fā)芽)及植物生長發(fā)育至關(guān)重要，逐漸成為評價植物品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)[10]。

20世紀(jì)80年代以來，對種子萌發(fā)代謝過程基本原理的認(rèn)識逐漸增加，但與基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)相比，對種子萌發(fā)的代謝組學(xué)及生物標(biāo)志物方面的研究還不夠全面，同時對玉米種子萌發(fā)的研究主要集中在種子萌發(fā)的生理變化、營養(yǎng)成分及遺傳機(jī)制方面[11-13]，對萌發(fā)過程的代謝過程研究較少。因此，本研究以玉米為試驗(yàn)材料，利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定種子不同萌發(fā)階段的相關(guān)代謝產(chǎn)物，明確種子不同萌發(fā)階段的代謝物差異，研究萌發(fā)階段的代謝物動態(tài)變化及代謝調(diào)控，試圖進(jìn)一步探索玉米種子萌發(fā)過程中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收變化規(guī)律，為進(jìn)一步提高玉米糧食品質(zhì)及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用華農(nóng)138玉米種子為供試材料，由天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)分析測試中心提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

按照GB/T 3543.4—1995標(biāo)準(zhǔn)萌發(fā)試驗(yàn)規(guī)程，選取籽粒飽滿的玉米種子，用5%次氯酸鈉浸泡15 min，去離子水沖洗3次后采用紙培法置于發(fā)芽盒中，置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，于8 h(A)、36 h(B)、80 h(C)、108 h(D)分別取樣液氮冷凍，保存于-80 ℃冰箱中待測，3次重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣品制備

將玉米樣品經(jīng)液氮冷凍后研磨至粉末，稱取150 mg加入體積比為1∶1∶1的乙腈-異丙醇-水混合溶液，超聲提取35 min(40 kHz，4 ℃)后10 000 r·min-1離心1 min，取上清液100 μL氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.3.2衍生化處理

取10 μL鹽酸甲氧胺吡啶溶液(40 mg·mL-1)加入樣品中置于30 ℃恒溫90 min后，向樣品中加入30 μL衍生劑(MSTFA+1%TMCS)置于37 ℃恒溫30 min，最后加入1 mL溶劑正庚烷(含20 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)物十一烷)過0.22 μm濾膜，轉(zhuǎn)入GC進(jìn)樣瓶待上機(jī)。

1.3.3GC-MS測定

試驗(yàn)儀器采用美國Aglient公司7890 A-5975 C型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管氣相色譜柱。載氣為純度99.999%的氦氣，進(jìn)樣模式不分流，進(jìn)樣量1 μL。進(jìn)樣口溫度250 ℃，升溫程序?yàn)橄扔沙厣?0 ℃維持1 min后，以10 ℃·min-1速度升至280 ℃，最后在280 ℃維持5 min。

質(zhì)譜條件：電子碰撞內(nèi)能為70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；溶劑延遲4.5 min；掃描速度為2 scan·s-1，范圍為50～500 m·z-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過GC-MS光譜全波段掃描玉米種子代謝物質(zhì)，Agilent-MassHunter工作站對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行特征提取，最后得到保留時間(rt)及峰面積(intensity)；導(dǎo)出數(shù)據(jù)至Microsoft Excel進(jìn)行整理，通過SIMCA-P進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)，SPSS進(jìn)行t檢驗(yàn)(Student’s t-test)，篩選差異代謝物，利用Omicshare平臺進(jìn)行聚類熱圖分析(HCA)、利用Metabo Analyst平臺進(jìn)行KEGG代謝通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS分析及差異代謝物鑒定

2.1.1GC-MS分析

對不同萌發(fā)階段的玉米種子進(jìn)行GC-MS分析，通過總離子流圖(圖1)可以看出，4份玉米材料中共掃描出116個峰，出峰時間集中在14～28 min之間，經(jīng)數(shù)據(jù)庫注釋后，4份玉米種子材料中共得到56個代謝物，如圖2所示，包括19種有機(jī)酸、12種氨基酸、15種糖及衍生物和10種化合物。在有機(jī)酸和糖及衍生物中，隨著發(fā)芽時間的增加代謝物的含量及數(shù)量均表現(xiàn)為上升趨勢，即D>C>B>A，其中糖類變化最明顯，D較A處理含量增加了134%；在氨基酸中，B代謝物數(shù)量為A的67%，總含量僅為A的38%，而A、C、D在總體上均表現(xiàn)為依次上升趨勢，即D>C>A>B；在其他化合物中，隨著萌發(fā)階段的變化，含量表現(xiàn)為C>A>D>B，而數(shù)量變化則表現(xiàn)為C>D>A>B。雖然氨基酸及化合物類物質(zhì)含量呈不規(guī)律變化，但代謝物總變化仍表現(xiàn)為代謝物含量及數(shù)量隨著萌發(fā)時間的增加而增加，對比萌發(fā)初期，其他萌發(fā)階段代謝物含量均在一定程度上有積累。

2.1.2差異代謝物鑒定

為鑒別玉米籽粒不同萌發(fā)階段的差異代謝物，對代謝物含量歸一化處理后進(jìn)行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)得到PLS-DA得分圖(圖3)，R2=0.984，Q2=0.997，同時為防止模型過擬合進(jìn)行交叉驗(yàn)證后所有點(diǎn)均小于原始R2，說明模型擬合較好且具有可行性。通過得分圖可以看出，該方法能較好的將不同萌發(fā)階段的玉米籽粒區(qū)分開，進(jìn)而得出投影變量投射重要度(Variable Importance for the Projection，VIP)(圖3)，圖中柱子高度越高差異越顯著[14]，結(jié)合PLS-DA與方差分析(one-way ANOVA)篩選差異代謝物(VIP>1且p<0.05)[15]。最終得出15種差異代謝物(表1)，分別為有機(jī)酸(6種，40%)、氨基酸(4種，27%)、糖類及其衍生物(1種，6%)、其他化合物(4種，27%)。

表1 玉米不同萌發(fā)時期差異代謝物

2.2 差異代謝物分析

2.2.1差異代謝物聚類分析

利用Omicshare軟件根據(jù)代謝物含量鑒定篩選出的差異代謝物，對不同萌發(fā)階段玉米籽粒進(jìn)行代謝物和萌發(fā)階段兩個維度的聚類熱圖分析(HCA)，如圖4所示，橫坐標(biāo)代表不同萌發(fā)階段，縱坐標(biāo)代表差異代謝物，其中紅色表達(dá)代謝物顯著上調(diào)，相應(yīng)藍(lán)色代表顯著下調(diào)，圖中A、C、D聚在一支，其中A較D存在更多有機(jī)酸類物質(zhì)的積累，C較A、D存在顯著的醋酸及膽固醇積累。與其相比B中可以觀察到顯著上調(diào)的糖、有機(jī)酸和氨基酸的積累，說明篩選出的差異代謝物能將不同萌發(fā)階段的玉米籽粒區(qū)分開來，同時不同萌發(fā)階段的差異代謝物經(jīng)過聚類也能明顯區(qū)分，說明不同代謝物在響應(yīng)不同萌發(fā)階段途徑上存在顯著差異。

2.2.2差異代謝物含量變化

碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪類物質(zhì)作為種子中的重要組成部分，其代謝產(chǎn)物糖類、有機(jī)酸、氨基酸分別在代謝過程中發(fā)揮重要作用。通過對不同萌發(fā)時期種子中不同差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析可以看出(圖4)，糖類物質(zhì)在種子吸水膨脹階段(B階段)含量顯著增加，氨基酸類物質(zhì)則隨著種子萌發(fā)過程的推進(jìn)，含量逐漸降低，當(dāng)種子達(dá)到D階段即發(fā)芽結(jié)束后，氨基酸含量又有所回升，而有機(jī)酸及其他化合物則表現(xiàn)為在萌芽初期存在一定含量，隨著萌發(fā)過程的推進(jìn)，在種子胚芽伸長階段(B階段)其含量下降到最低水平后，有機(jī)酸和化合物含量繼續(xù)攀升，在種子發(fā)芽基本完成后(C階段)達(dá)到最高水平，隨后逐漸降低。

2.3 KEGG通路分析

將篩選出的差異代謝物導(dǎo)入Metabo Analyst，得到代謝通路氣泡圖(圖5)，其中氣泡大小代表影響因子大小，氣泡越大影響因子越大；顏色深淺代表P值大小，顏色越深P值越小，小分子代謝物積累程度越高[16]。同時利用拓?fù)銯enix進(jìn)行通路分析，經(jīng)分析映射出13條可能的代謝通路(表2)，代謝途徑6條，生物合成途徑5條，轉(zhuǎn)化途徑1條，降解途徑1條。其中5條與有機(jī)酸有關(guān)，3條與氨基酸有關(guān)，可見不同萌發(fā)階段主要對玉米籽粒中的氨基酸及有機(jī)酸類物質(zhì)產(chǎn)生影響。經(jīng)分析后篩選得出1條具有顯著意義的途徑(p<0.05或Impact >0.2)，為甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，這條途徑與氨基酸代謝有關(guān)，有兩個差異代謝物富集到此途徑上，分別為甘氨酸和絲氨酸。

表2 代謝通路富集結(jié)果

3 結(jié)論與討論

種子萌發(fā)作為植物生長發(fā)育中最初階段也是關(guān)鍵階段[4]，萌發(fā)過程中種子中的貯藏物質(zhì)隨著代謝過程不斷發(fā)生變化，直接影響種子中代謝物的積累，來吉祥等[17]研究表明，萌發(fā)可以提高谷豆類作物中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，同時降低種子中的有害物質(zhì)。玉米作為重要的雜糧糧食作物，其中的糖類及蛋白質(zhì)類等營養(yǎng)物質(zhì)的利用率較低，董艷等[18]研究表明，經(jīng)發(fā)芽處理后的雜糧營養(yǎng)結(jié)構(gòu)及保健功能可以得到一定程度的提高。

本研究利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)結(jié)合生物統(tǒng)計學(xué)方法對玉米種子華農(nóng)138萌發(fā)過程中的四個階段(8 h、36 h、80 h、108 h)進(jìn)行代謝組學(xué)分析，對比萌芽初期階段，其余發(fā)芽過程中的代謝產(chǎn)物含量均有增加，其中糖類變化最為明顯，糖類作為淀粉物質(zhì)的主要分解產(chǎn)物，在種子萌發(fā)初期發(fā)揮重要作用，糖類物質(zhì)參與的糖酵解等代謝途徑是種子萌發(fā)的主要能量來源[19]，在本研究中，對篩選出的15種差異代謝物進(jìn)行分析，糖類物質(zhì)在種子萌發(fā)初期萌動階段含量顯著增加，這與薛梅真等[10]對玉米萌發(fā)初期可溶性糖代謝機(jī)制研究結(jié)果一致。脂肪作為種子中的重要儲能物質(zhì)，其在種子萌發(fā)過程中提供的能量來源為淀粉或蛋白質(zhì)類物質(zhì)的2倍[20]，在種子萌發(fā)的過程中，脂肪通過水解等方式轉(zhuǎn)化為甘油、脂肪酸等有機(jī)酸類物質(zhì)參與代謝途徑，為發(fā)芽提供能量。本研究中，在不同萌發(fā)階段篩選出的差異代謝物存在6種有機(jī)酸，共參與了5條差異代謝途徑，隨著種子萌發(fā)吸脹進(jìn)程的推進(jìn)，細(xì)胞不斷吸水破裂導(dǎo)致脂肪類有機(jī)酸外滲[20]，種子中有機(jī)酸含量不斷降低，在萌動階段達(dá)到最低水平，隨后含量增加在發(fā)芽階段達(dá)到最高值后逐漸下降，這與油料作物種子萌發(fā)過程中脂肪酸的變化趨勢相同[21]，由于在種子的萌發(fā)過程中，萌動階段通過糖酵解途徑提供的能量不足以滿足發(fā)芽階段種子的生命活動需要，脂肪在萌發(fā)階段水解通過乙醛酸循環(huán)、丙酮酸代謝等途徑不斷轉(zhuǎn)化為小分子有機(jī)酸類物質(zhì)，為種子繼續(xù)提供能量。蛋白質(zhì)作為玉米種子中的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其降解產(chǎn)物氨基酸是人類生命活動所必需的，有研究表示，種子的萌發(fā)過程可以有效改善作物中的氨基酸含量，同時提高人體所需的必需氨基酸指數(shù)[22]，在本研究中，差異代謝物中存在4種差異氨基酸參與了3條代謝途徑，其中甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝途徑具有顯著意義，同時差異氨基酸在玉米種子的吸脹階段含量水平較高，而隨著發(fā)芽進(jìn)程的推進(jìn)含量不斷降低，在發(fā)芽階段含量達(dá)到最低值，隨后在成苗階段攀升至最高水平，說明種子在萌發(fā)過程中，氨基酸類物質(zhì)在種子吸水激活后不斷為種子的呼吸氧化過程提供碳源及氮源[23]。

本研究通過對玉米種子萌發(fā)過程不同階段(吸脹階段、萌動階段、發(fā)芽階段、成苗階段) 代謝物含量進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)在玉米種子發(fā)芽過程中，差異代謝物主要集中在有機(jī)酸、氨基酸及糖類物質(zhì)，存在一條氨基酸代謝途徑具有顯著意義，在玉米種子發(fā)芽初期的吸脹、萌動階段糖類物質(zhì)水平最高，提供主要能量來源，而當(dāng)?shù)竭_(dá)發(fā)芽階段種子中的脂肪降解提供能量，有機(jī)酸含量達(dá)到最顯著水平，而在種子萌發(fā)的全過程中，氨基酸含量逐漸降低，當(dāng)發(fā)芽完成后成苗階段，氨基酸水平達(dá)到最高。本研究利用代謝組學(xué)手段研究了不同萌發(fā)階段種子中代謝物含量差異，完成了不同萌發(fā)階段的差異代謝物篩選及代謝通路鑒別，這可以為提高玉米中營養(yǎng)利用率及發(fā)展高效優(yōu)質(zhì)玉米品種提供一定的理論參考。