馮 娜， 李景環(huán)

(內(nèi)蒙古師范大學生命科學與技術(shù)學院， 呼和浩特 010020)

野大麥(HordeumbrevisubulatumL.)為禾本科大麥屬的多年生草本植物[1]，在我國，分布于東北、內(nèi)蒙古、陜西北部、寧夏、甘肅、青海、新疆、西藏等省區(qū)[2]。野大麥適口性好、適應(yīng)性廣且具有較強的耐鹽性，營養(yǎng)豐富，粗蛋白含量高，是優(yōu)良飼草。此外，野大麥有較強的耐鹽堿、耐寒、抗病蟲害等能力，是禾本科小麥族耐鹽性最強的鹽生植物之一[3-4]，可用于改良鹽堿地，具有很高的經(jīng)濟價值和飼用價值。一直以來小麥和牧草育種學家選擇野大麥作為優(yōu)良的基因資源，對小麥和飼草進行改良，育成了具有耐鹽堿的新品種。雜交育種離不開細胞遺傳學的指導(dǎo)，染色體的核型分析就是一種細胞遺傳學分析方法。

染色體核型又稱染色體組型，核型分析是對細胞有絲分裂中期染色體的各種特征進行定性和定量表述的一種分析方法，包括染色體數(shù)目、染色體形態(tài)、染色體分子特征等[5]。染色體核型分析廣泛應(yīng)用在物種系統(tǒng)分類、起源與鑒定、親緣關(guān)系分析等方面，而高質(zhì)量的染色體制片和染色體上清晰可辨的標識是準確進行核型分析的保障[6]。

熒光原位雜交技術(shù)可以為核型分析提供清晰的標識，該技術(shù)是將熒光素標記的探針代替同位素標記與待測樣品中的待測序列以堿基互補配對原則結(jié)合在一起，常用的標記物有生物素標記、地高辛標記等。目前，熒光原位雜交技術(shù)已經(jīng)成為一種非常重要的原位雜交技術(shù)[7]，憑著其特征顯著、分辨率高、穩(wěn)定性強、操作安全便捷等特點，已經(jīng)應(yīng)用于產(chǎn)前診斷[8-9]、唐氏綜合征、膀胱癌等[10-11]臨床醫(yī)學，以及染色體結(jié)構(gòu)變異的檢測和標記基因定位[12]等生物學領(lǐng)域，在細胞遺傳學、表觀遺傳學、分子生物學等方面也有較高的研究價值。在高等真核生物中，45 SrDNA是高度保守的序列，是編碼rRNA的基因[13]。45 SrDNA在核仁組織區(qū)上[14]，一般位于隨體染色體的核仁組織區(qū)[15]，5 SrDNA是編碼5 SrRNA的基因。重復(fù)序列pAs 1和pSc 119.2在小麥族植物染色體中廣泛存在，是微衛(wèi)星序列。45 SrDNA、5 SrDNA、pAs 1和pSc 119.2序列是植物染色體原位雜交實驗中常用的探針序列[16-18]。

以野大麥為試驗材料，采用45 SrDNA、5 SrDNA、pAs 1和pSc 119.2這4種序列制備的探針，與野大麥的根尖細胞有絲分裂中期染色體進行熒光原位雜交并分析，構(gòu)建核型，確立各個標記信號在染色體上的分布特點,以期為野大麥的系統(tǒng)研究和雜交育種提供理論參考，同時為大麥屬植物以及小麥族近緣種植物的分類學和細胞學等研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗使用的野大麥種子由內(nèi)蒙古師范大學生命科學與技術(shù)學院李景環(huán)老師提供。

1.2 方 法

1.2.1野大麥體細胞染色體標本制備

選取野大麥飽滿充實的種子放入墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，放于最適溫度為25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待根部長到1.5 cm左右時，于上午剪取根尖作為試驗材料。冰水混合物進行預(yù)處理，預(yù)處理結(jié)束后用蒸餾水洗凈，置于卡諾固定液固定8 h， 2%的纖維素酶進行解離，改良石炭酸品紅染液染色1 h。之后壓片和鏡檢，選取染色體清晰可見的裝片，冰凍揭片，梯度乙醇脫水，備用。

1.2.2探針標記

堿裂解法分別提取攜帶45 SrDNA、5 SrDNA、pAs 1 DNA和 pSc 119.2 DNA的質(zhì)粒DNA，采用DNA缺口平移法，用地高辛-dUTP標記5 SrDNA探針和pAs 1 DNA探針，生物素標記45 SrDNA和pSc 119.2 DNA探針。4種探針由南京農(nóng)業(yè)大學提供。

1.2.3熒光原位雜交

利用45 SrDNA、5 SrDNA、pAs 1 DNA和pSc 119.2 DNA探針與野大麥的根尖中期染色體進行原位雜交，原位雜交具體步驟參照李景環(huán)等[19]的方法，用Olympus BX 51熒光顯微鏡觀察并拍照保存。

1.2.4核型分析

對獲得的圖片和數(shù)據(jù)等進行處理，選擇30個以上染色體分散良好的中期分裂相細胞進行染色體計數(shù)，85%的細胞中染色體數(shù)目一致，則該數(shù)目確定為該物種的染色體數(shù)。選擇染色體分散清晰的5個細胞的分裂相進行核型參數(shù)的測量和計算，測量染色體長臂值和短臂值，并計算染色體的相對長度和臂比，最后取5個細胞的各項參數(shù)平均值作為核型分析的參數(shù)。同時結(jié)合熒光原位雜交獲得的標記信號，對染色體進行同源配對，構(gòu)建核型分析圖和核型公式，核型分析的方法一般參照李懋學和陳瑞陽[20]的標準進行，以Levan等[21]的公式計算相對長度，核型分類采用Stebbins[22]的分類標準進行。

采用染色體分析軟件Karyo 3.1進行長度測量，繪制染色體核型圖。利用Excel軟件計算相對長度等參數(shù)，并作出核型參數(shù)表。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目分析

根據(jù)染色體核型分析標準，85%以上的細胞具有的染色體數(shù)目確定為是該物種的染色體數(shù)目[20]。在本實驗中，選擇30個中期分裂相細胞進行計數(shù)得出，野大麥根尖細胞染色體數(shù)目為2 n=28，如圖1和圖2。

2.2 熒光原位雜交標記信號分析

選取5個染色體分散清晰的細胞，用Olympus BX 51進行圖片采集，再用Karyo 3.1軟件進行長度測量，計算核型參數(shù)，同時結(jié)合四種探針的熒光原位雜交標記信號的特征，進行同源染色體配對，得到野大麥根尖細胞染色體原位雜交圖和染色體核型圖，見圖1和圖2。

由圖1和圖2可知，野大麥的染色體數(shù)目為2 n=28條。45 SrDNA的數(shù)目與具有隨體的染色體數(shù)相同[23]，因此野大麥有6對具有隨體的染色體，分別位于第6號、第10號、第11號、第12號、第13號和第14號染色體的短臂上。

通過觀察圖1和圖2可以看到，在Olympus BX 51熒光顯微鏡采集的圖片中，用地高辛-dUTP標記的5 SrDNA探針和pAs 1 DNA探針顏色為紅色；生物素標記的45 SrDNA和pSc 119.2 DNA探針顏色為綠色。45 SrDNA和5 SrDNA探針同時與野大麥根尖中期染色體進行原位雜交，如圖1；pAs 1 DNA和pSc 119.2 DNA探針同時與野大麥染色體進行雜交，如圖2；DAPI復(fù)染后的染色體呈現(xiàn)為藍色。由圖1可以看到，5 SrDNA位于第10號和第14號染色體的短臂上；45 SrDNA定位在6對染色體上，分別定位于第6號、第10號、第11號、第14號染色體的短臂上，信號較強，第12號、第13號染色體上的45 SrDNA位于近著絲粒的位置上，但是第12號染色體上的45 SrDNA熒光信號強，而第13號染色體上的45 SrDNA熒光信號較弱；第10號和第14號染色體上同時出現(xiàn)了45 SrDNA和5 SrDNA的雙色雜交信號。pAs 1 DNA的熒光信號出現(xiàn)在所有的染色體上，大部分位于染色體的端部，第7號和第9號染色體的pAs 1 DNA則位于中部且信號較弱； pSc 119.2 DNA分布于第7號、第10號和第14號共3對染色體上，且都位于染色體短臂的末端，但信號強弱不同，在第7號染色體上pSc 119.2 DNA信號較強，第10號染色體的一條染色體的短臂末端信號較強，但是另一條染色體沒有出現(xiàn)熒光信號，第14號染色體的pSc 119.2 DNA信號較弱；pAs 1 DNA和pSc 119.2 DNA雙色雜交位點出現(xiàn)在第7號、第10號和第14號染色體上。

2.3 染色體核型參數(shù)

核型參數(shù)可以反映一個物種的進化程度，核型是由對稱向不對稱發(fā)展[22]。野大麥核型參數(shù)的計算，是通過Karyo 3.1軟件對染色體的長臂、短臂進行測量，然后用Excel軟件計算染色體相對長度和臂比，根據(jù)臂比確定染色體的著絲粒類型。野大麥中期染色體的核型參數(shù)見表1。

表1 野大麥染色體核型參數(shù)

由表1可以看出，野大麥的根尖細胞染色體數(shù)目為2 n=28，染色體組總長度為92.269 μm，平均絕對長度為6.591 μm，染色體的絕對長度變化范圍為7.581～5.486 μm，染色體的相對長度變化范圍為8.216%～5.946%，最長染色體與最短染色體長度比值為1.382；臂比最大值為1.628，最小值為1.079，根據(jù)著絲粒位置來分，野大麥的染色體都為m型(中部著絲粒)，沒有出現(xiàn)臂比值大于2的染色體，核型類型屬于1 A型(最對稱的核型)，核型不對稱系數(shù)為57.227%。核型公式為2 n=4 x=28=28 m(12 SAT)。

3 討 論

3.1 熒光原位雜交

熒光原位雜交技術(shù)具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，可以在同一個染色體片上顯示出不同的DNA探針的定位，被廣泛應(yīng)用于各種染色體檢測、定位研究中[24]。在試驗過程中，最為重要的就是特異性探針序列的選擇[24]，本研究選擇小麥族的45 SrDNA序列、5 SrDNA序列、高度重復(fù)序列pAs 1 DNA和pSc 119.2作為探針，這些探針常用來分析小麥族物種的親緣關(guān)系和進化[23-26]。

孔芳等[23]認為，45 SrDNA 的數(shù)目與具有隨體的染色體數(shù)相同，在染色體的次縊痕處，以此確定野大麥有6對染色體有隨體。Mantovani等[27]認為，5 SrDNA原位雜交位點數(shù)目以一對或兩對為主，但在染色體上沒有穩(wěn)定不變的分布位置，這與本研究5 SrDNA的定位結(jié)果基本一致。rDNA是進化上高度保守的序列，尤其是在同一物種的同源染色體上的位置和拷貝數(shù)基本相同，這為核型分析進行染色體的配對提供了清晰可見的標識，利于準確配對。但是在同屬不同物種中rDNA的位置和拷貝數(shù)會有所不同，這可以用于物種的分類和演化研究[23]。

pAs 1 DNA序列和的pSc 119.2 DNA在遺傳上也是相對保守的，尤其體現(xiàn)在分布位置上。pAs 1 DNA一般集中分布在端部和著絲粒處，對于近緣物種而言都位于大致相同的位置，但是在不同的物種中會表現(xiàn)出不同的拷貝數(shù)；本實驗顯示pSc 119.2 DNA分布于野大麥部分染色體的末端，且信號較強。從本實驗結(jié)果看出，pAs 1 DNA和pSc 119.2 DNA可以作為一種熒光標記來進行染色體同源配對。

有了明顯的熒光標記可以推斷染色體的進化，本實驗中10號染色體出現(xiàn)了一條沒有標記pSc 119.2信號的結(jié)果，再結(jié)合45 SrDNA和5 SrDNA的標記結(jié)果配對，推測10號染色體可能是發(fā)生了染色體頂端的缺失。

3.2 野大麥核型

染色體核型分析對植物的系統(tǒng)分類、物種的遺傳進化提供了基礎(chǔ)[28]。丁鴻等[29]在2012年發(fā)表了植物染色體標本的制備和染色體核型分析研究進展，認為核型分析技術(shù)是細胞遺傳學中最基本最常用的方法，在植物分類、起源、演化等方面都有重大意義，也為以后核型分析的發(fā)展做出了展望。本研究根據(jù)檢測到的45 SrDNA和5 SrDNA熒光原位雜交信號的數(shù)量、強弱和位置等，成功將野大麥6對染色體配對，提高了染色體配對的精確性，為野大麥染色體核型模型的建立提供了支持。pAs 1 DNA序列和pSc 119.2 DNA也為核型分析提供了明顯的可視標記。由此可見，熒光原位雜交技術(shù)使常規(guī)的染色體核型分析更為便捷準確。

有關(guān)野大麥染色體核型的研究于立華等[30]得到的核型公式為2 n=4 x=28=22 m(4 SAT)+6 sm(2 SAT)，本研究結(jié)果為2 n=4 x=28=28 m(12 SAT)。兩種結(jié)果除了染色體數(shù)目相同外，其他的核型特征相差很大。表現(xiàn)在具隨體的染色體、著絲粒類型、染色體的對稱類型。于立華的結(jié)果為6條染色體具隨體，本研究具隨體的染色體為12條，隨體的分布除了與物種本身特征有關(guān)外，與制片的方法以及染色體識別的方法也有直接關(guān)系。常規(guī)染色體制圖得到的染色體圖片，如果隨體特別小，就很難識別；孔芳等[23]認為，45 SrDNA的數(shù)目與具有隨體的染色體數(shù)相同，所以帶有45 SrDNA探針標記的染色體容易識別，本研究的隨體就是結(jié)合45 SrDNA探針進行判斷的。關(guān)于染色體的著絲粒類型，于立華的研究結(jié)果是11對中著絲粒染色體，3對近中著絲粒染色體，本研究的結(jié)果都是中部著絲粒染色體，對于著絲粒的判斷，如果僅靠染色體形狀判斷一定會有誤差，最好的辦法是采用著絲粒處序列的熒光標記，本研究和于立華的著絲粒判別都是根據(jù)主縊痕的凹陷進行判斷的，會存在一定的誤差，因此結(jié)果不一致。根據(jù)Stebbins的核型分類標準將野大麥確定為1 A型，最對稱的核型，于立華的結(jié)果2 B類型，這個結(jié)果主要依賴于染色體長度測量的準確性和配對的準確性，當然造成差異的原因有很多，首先可能是操作手法和處理方法、使用試劑上會有不同導(dǎo)致結(jié)果的不同，對數(shù)據(jù)的處理也有不同。因此要想更準確的進行核型分析，要保證染色體的特征明晰，測量方法誤差小，可識別的熒光標記種類適當并且容易辨別，要想更準確地進行核型分析，還應(yīng)該進行更多標識的探針雜交。

4 結(jié) 論

5 SrDNA位于第10號和第14號染色體的短臂上；45 SrDNA位于第6號、第10號、第11號、第12號、第13號和第14號染色體的短臂上；pAs 1 DNA的熒光信號出現(xiàn)在大部分染色體的端部和部分在著絲粒區(qū)域；pSc 119.2的熒光信號出現(xiàn)在第7號和第14號染色體短臂的頂端，第10號染色體一條短臂的頂端，另一條染色體可能頂端缺失導(dǎo)致沒有出現(xiàn)pSc 119.2熒光信號。

核型公式為2 n=4 x=28=28 m(12 SAT)，核型類型屬于1 A型，為最對稱的核型，核型不對稱系數(shù)為57.227%，在系統(tǒng)演化上為較原始的種類，進化程度低。

適當全面的熒光標記種類使染色體核型分析更為準確便捷。