王海鳳 胡江波 許夢婷 唐賽賽

摘 要：目的：探討香菇多糖（LNT）與阿霉素（ADR）聯(lián)合應(yīng)用對胃癌SGC7901細胞凋亡及耐藥基因表達的影響。方法：CCK8法檢測不同濃度香菇多糖對胃癌SGC7901細胞增殖的影響，確定非細胞毒性香菇多糖的濃度;將胃癌細胞株SGC7901分為空白對照組、ADR組、ADR+LNT組，流式細胞儀檢測香菇多糖與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對SGC7901細胞凋亡的影響;實時熒光PCR檢測香菇多糖與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對耐藥基因ZNF139、MRP-1和MDR1的轉(zhuǎn)錄表達的影響。結(jié)果：確定30 μg/mL香菇多糖為最大非細胞毒性濃度進行后續(xù)實驗;與空白對照組及ADR組比，ADR+LNT組SGC7901/ADR細胞凋亡率明顯增加（P<0.05）;與空白對照組比，ADR組ZNF139、MDR1、MRP-1基因的表達明顯升高（P<0.01），ADR+LNT組MRP-1基因的表達明顯降低;與ADR組相比，ADR+LNT組ZNF139、MRP-1基因的表達明顯降低（P<0.01）。結(jié)論：香菇多糖與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用可促進胃癌SGC7901細胞凋亡，抑制耐藥基因ZNF139、MRP-1的表達，逆轉(zhuǎn)胃癌SGC7901細胞對阿霉素耐藥性。

關(guān)鍵詞：香菇多糖;阿霉素;胃癌SGC7901細胞;凋亡;耐藥基因

香菇是起源于我國的世界第二大食用菌[1]。香菇多糖（Lentinan，LNT）是一種從香菇中提取的活性成分，是純化的β-1，3-葡聚糖[2]。目前，香菇多糖在臨床上被廣泛用于腫瘤的輔助治療。腫瘤耐藥性的產(chǎn)生是導(dǎo)致治療失敗的主要原因，逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性是提高腫瘤治療療效的關(guān)鍵。本研究以胃癌細胞SGC7901為模型，探討香菇多糖聯(lián)合阿霉素對胃癌細胞凋亡及耐藥基因表達的影響，為香菇多糖抗腫瘤作用機制提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞株SGC7901購自上海美軒生物科技有限公司。

1.2 試劑

香菇多糖（批號1902271）、注射用鹽酸阿霉素（ADR）（25 mg，批號：G1823064）、RPMI-1640完全培養(yǎng)基（KGM31800S-500）、CCK8法細胞增殖檢測試劑盒（KGA317）、Trizon Reagent（CW0580S）、Ultrapure RNA 超純RNA提取試劑盒（CW0581M）、HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒（CW2569M）、UltraSYBR Mixture（CW0957M），均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;Annexin V-APC/7-AAD apoptosis kit（AP105-100kit）購自MULTI SCIENCES公司。

1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱（BPN-80CW），上海一恒科學(xué)儀器有限公司;倒置熒光顯微鏡（MF53），廣州市明美光電有限公司;多功能酶標(biāo)儀（02L3006），TECAN;熒光PCR儀（CFX Connect?實時），伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司;低溫高速離心機（TGL-16D），常州中捷實驗儀器制造有限公司;NovoCyte?流式細胞儀（NovoCyte 2060R），艾森生物（杭州）有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 CCK8法檢測香菇多糖對SGC7901細胞增殖的影響

實驗設(shè)7組，分為空白對照組、6個不同濃度香菇多糖實驗組。取對數(shù)生長期SGC7901細胞以1×104個/孔接種于96孔板的100 μL培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至貼壁約70%。實驗組向完全培養(yǎng)基中按20%的比例加入用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的香菇多糖，使其終濃度依次為10 μg/mL、30 μg/mL、50 μg/mL、70 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，空白對照組加等體積培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK8檢測溶液，再置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，振蕩混勻，在酶標(biāo)儀上于波長450 nm處讀取光密度值（OD值），重復(fù)實驗3次，計算細胞生長率，見式（1）。以生長率大于90%的最高藥物濃度作為非細胞毒性濃度，作為后續(xù)實驗的給藥量。

細胞生長率=（實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.4.2 細胞造模及分組

取對數(shù)生長期SGC7901細胞，棄去細胞培養(yǎng)上清，用1×PBS洗兩遍，用0.25%胰酶（含0.02% EDTA）消化，離心、洗滌、重懸，按40%比例將細胞接種于6孔板，待細胞完全貼壁后，棄去上清，設(shè)空白對照組、阿霉素組（ADR組）、阿霉素和香菇多糖聯(lián)合用藥組（ADR+LNT組）?？瞻讓φ战M加培養(yǎng)液1 000 μL，ADR組向SGC-7901細胞中加入含ADR（5.0 μg/mL）的培養(yǎng)液1 000 μL，ADR+LNT組向SGC-7901細胞中加入含ADR（5.0 μg/mL）與20%香菇多糖（終濃度為上述非細胞毒性濃度）培養(yǎng)液1 000 μL，培養(yǎng)48 h后進行流式檢測和PCR檢測。

1.4.3 流式細胞儀檢測阿霉素與香菇多糖聯(lián)合用藥對細胞凋亡的影響

收集1×106～3×106個細胞，加1 mL PBS，1 500 r/min離心3 min，洗2遍，用雙蒸水將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer，取300 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer重懸細胞。每管各加入3 μL的Annexin V-APC和5 μL的7-AAD，混勻后，室溫避光孵育10 min，再向每管中加入200 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer，上機檢測。

1.4.4 qPCR檢測香菇多糖對多藥耐藥相關(guān)基因的影響

按試劑盒說明書，抽提各組SGC7901細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進行檢測，以GAPDH為內(nèi)參，計算出各組ZNF139、MRP-1、MDR1的相對表達量。ZNF139、MRP-1、MDR1引物序列見表1。

反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。每個實驗重復(fù)3次取平均值，檢測各組SGC7901細胞內(nèi)ZNF139、MRP-1、MDR1表達情況。

1.4.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，獨立樣本之間比較采用方差分析，以P<0.05作為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度香菇多糖對SGC7901細胞增殖的影響

由表2可知，30 μg/mL香菇多糖（生長率93.3%）為非細胞毒性濃度，作為后續(xù)實驗的給藥量。

2.2 香菇多糖對SGC7901細胞凋亡率的影響

由表3可知，與空白對照組比，ADR組和ADR+LNT組SGC7901細胞凋亡率明顯升高（P<0.01）。與ADR組相比，ADR+LNT組SGC7901細胞凋亡率明顯升高（P<0.01）。

2.3 香菇多糖對SGC7901細胞耐藥基因表達的影響

由表4可知，與空白對照組比，ADR組ZNF139、MDR1、MRP-1基因的表達明顯升高（P<0.01），ADR+LNT組MRP-1基因的表達明顯降低。與ADR組相比，ADR+LNT組ZNF139、MRP-1基因的表達明顯降低（P<0.01），MDR1表達有降低趨勢但無顯著性差異。

3 討論

化療可有效遏制胃癌細胞的增殖，但在化療中胃癌細胞多藥耐藥（MDR）的產(chǎn)生常導(dǎo)致化療效果不佳[3]。阿霉素是廣譜抗腫瘤藥物，其本身毒性較大，但治療效果明顯，至今依然沿用。2017年阿霉素被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)統(tǒng)計在致癌物清單中，所以減少用量以及與其他抗癌藥物聯(lián)用成了新的研究趨勢。

本實驗通過不同濃度香菇多糖對SGC7901細胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)（表2），低濃度香菇多糖（10 μg/mL）對SGC7901細胞增殖有一定的促進作用，當(dāng)香菇多糖濃度達到30 μg/mL時開始抑制細胞增殖，當(dāng)香菇多糖濃度達到100 μg/mL及以上時可顯著抑制SGC7901細胞增長（P<0.05、（P<0.01），表明香菇多糖必須達到一定的藥物濃度方能起到抗腫瘤作用。通過流式檢測細胞凋亡實驗發(fā)現(xiàn)（表3），香菇多糖聯(lián)合阿霉素應(yīng)用可明顯誘導(dǎo)胃癌SGC7901細胞凋亡的發(fā)生，說明香菇多糖與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用可促進胃癌細胞凋亡的發(fā)生，為阿霉素聯(lián)合用藥提供實驗依據(jù)。

介導(dǎo)腫瘤耐藥的蛋白包括P-糖蛋白（P-Glycoprotein，P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（Multidrug Resistance-Associated Protein，MRP）、鋅指蛋白（ZNF）等[3-5]。本研究通過qPCR檢測各組胃癌細胞SGC7901耐藥相關(guān)基因ZNF139、MDR1、MRP的表達，結(jié)果顯示（表4），與空白對照組比較ADR組ZNF139、MDR1、MRP-1基因的表達明顯升高（（P<0.01），表明阿霉素可通過促進胃癌細胞耐藥基因的表達導(dǎo)致化療失敗。與空白對照組相比ADR+LNT組MRP-1基因的表達明顯降低，與ADR組相比ADR+LNT組ZNF139、MRP-1基因的表達明顯降低（（P<0.01），MDR1表達有降低趨勢但無顯著性差異，表明香菇多糖與ADR聯(lián)合應(yīng)用可抑制SGC7901/ADR細胞多藥耐藥相關(guān)基因ZNF139、MRP-1的表達。

4 結(jié)論

本研究初步表明香菇多糖可抑制胃癌SGC7901細胞的增殖，與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用可促進SGC7901細胞凋亡，亦可抑制胃癌SGC7901細胞耐藥基因ZNF139、MRP-1的表達而逆轉(zhuǎn)化療中對阿霉素耐藥的發(fā)生。

參考文獻

[1]唐慶九，王淑蕾，王晨光，等.香菇子實體中單核苷類成分研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（3）：283-286.

[2]張晶，蘇暢，賈英杰，等.香菇多糖抗腫瘤治療臨床應(yīng)用進展[J].天津中醫(yī)藥，2019，36（11）：1137-1140.

[3]陳磊，唐圣松.P-糖蛋白在乳腺癌多藥耐藥中的作用及其調(diào)控機制[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2014，30（3）：248-254.

[4]劉光，丁華野，皋嵐湘，等.乳腺癌中Vimentin與P-糖蛋白表達和其它預(yù)后指標(biāo)的相關(guān)性研究[J].中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2001，10（2）：179-181.

[5]戴金鋒，蔡利軍，陳超英，等.溫郁金逆轉(zhuǎn)胃癌SGC7901/VCR多藥耐藥性機制的研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，34（12）：1507-1511.