胡漢瓊，廖子玲，康 寧，李 仝，宋鳳麗

(1. 北京中醫(yī)藥大學,北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029)

放射治療是惡性腫瘤的重要治療手段之一，放射線電離輻射在殺傷具體病灶的腫瘤細胞時，也損傷了正常組織細胞，可引起照射野內(nèi)不同部位不同程度的炎癥反應(yīng)。其中最常見的是放射性皮炎，癥狀常表現(xiàn)為照射野局部瘙癢、疼痛、紅斑、紅腫、潰瘍、滲出、脫屑、色素沉著、纖維化等。相關(guān)研究表明，91.4%的腫瘤患者在放射治療期間會出現(xiàn)皮膚損傷，因放射性皮炎程度嚴重而導(dǎo)致中斷放療進程的概率高達58.1%[1]，因此放射性皮炎成為確保腫瘤患者治療進程而亟待解決的問題。但目前國內(nèi)外對于放射性皮炎的防治無統(tǒng)一治療標準，仍處于探索階段，多數(shù)是從外用輻射防護劑及乳膏等方面研究，例如奧克噴、三乙醇胺乳膏、磺胺嘧啶銀乳膏、美寶濕潤燒傷膏等，部分國外學者還從光生物調(diào)節(jié)療法、醫(yī)療設(shè)備等方面進行了研究[2-3]?？祵幍萚4-6]基于北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院腫瘤血液科長期的臨床用藥經(jīng)驗及臨床試驗研究，發(fā)現(xiàn)外用加味四妙勇安油可能通過誘導(dǎo)免疫應(yīng)答增強抗病能力，減少炎性因子釋放，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生從而促進急性放射性皮炎創(chuàng)面愈合。本研究通過肉眼及鏡下觀察皮膚的組織形態(tài)學變化探討了加味四妙勇安油外用對大鼠急性放射性皮炎創(chuàng)面的影響，旨在進一步明確外用加味四妙勇安油的作用。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康Wistar雌性大鼠75只，購于斯貝福動物公司，飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床研究所動物房，于SPF條件下飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對濕度40%～70%，持續(xù)12 h明暗交替日光燈照明，以無菌消毒處理的標準鼠食飼養(yǎng)、飲水，自由活動，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進行實驗。實驗動物飼養(yǎng)與處理遵守中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定。

1.2藥物制備 加味四妙勇安油由玄參90 g、金銀花90 g、當歸60 g、生黃芪30 g、紫草30 g、連翹30 g、蒲公英30 g、甘草10 g、冰片10 g等組成，上述藥物均為配方顆粒劑(北京康仁堂藥業(yè)有限公司)，將藥物與葵花籽食用調(diào)和油(天津瑞佳訊貿(mào)易有限公司)200 mL混合加熱至(100±1)℃，冷卻后得到深褐色油劑即為加味四妙勇安油，整個制備過程在醫(yī)院內(nèi)進行。復(fù)方維生素B12溶液(貫新克)25 mL/瓶，長春精優(yōu)藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H10980223。

1.3主要儀器及試劑 醫(yī)科達(Ekelta)直線加速器(瑞典)；HE染色試劑、天狼星紅染色試劑(北京索萊寶科技有限公司)；光學顯微鏡(ZEISS ImagerAl)。

1.4動物模型制備及分組干預(yù) 參照文獻[7-8]并結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果，將75只雌性Wistar大鼠雙后肢、臀部、全尾剃毛后，暴露在6MeV電子射線下,吸收劑量率400 cGy/min，照射距離1 m，照射時間10 min，吸收劑量40 Gy，對大鼠雙后肢、臀部、全尾部位的皮膚照射1次，產(chǎn)生 10%Ⅱ度放射性皮炎，其他部位用鉛磚遮蓋。其癥狀包括躁狂、進食減少，照射野皮膚出現(xiàn)紅斑、拒絕接受觸碰等。采用隨機數(shù)字表法將75只照射后的大鼠均分為3組：生理鹽水組每日使用生理鹽水對照射野進行常規(guī)護理，不進行給藥處理；加味四妙勇安油組和復(fù)方維生素B12組在常規(guī)護理基礎(chǔ)上，分別于照射處皮膚外涂四妙勇安油和復(fù)方維生素B12溶液，均1次/d,每次用藥以均勻覆蓋創(chuàng)面為宜。

1.5觀察指標及方法

1.5.1一般情況及創(chuàng)面情況 每天觀察各組大鼠精神狀態(tài)、攝食進水等一般情況和創(chuàng)面皮損情況(如創(chuàng)面紅腫、潰瘍、滲出、皮膚新生等)。

1.5.2創(chuàng)面發(fā)生率 分別于照射后8 d、15 d、30 d、45 d、60 d，采用紙片增重法計算創(chuàng)面發(fā)生率。具體方法：將透明薄紙貼于創(chuàng)面上，勾勒出創(chuàng)面范圍(即創(chuàng)面紅腫、潰瘍、滲出、新生的最大范圍)，再以此為模板，將質(zhì)地均勻的硬紙板剪成同樣大小，然后將硬紙板稱重并記錄，其與整個照射野面積的紙板重量的比值×100%即為當天創(chuàng)面發(fā)生率，數(shù)值越小代表創(chuàng)面越小。

1.5.3皮膚組織形態(tài)學觀察 每組分別于照射后8 d、15 d、30 d、45 d、60 d各處死5只大鼠，取照射區(qū)新鮮的皮膚組織，放置于盛有10%福爾馬林液的離心管中固定，24 h后取出修整使切面平整，置入梯度酒精脫水、浸蠟包埋。將修整好的蠟塊置于石蠟切片機上連續(xù)切片成3 μm厚度。將切片漂浮于50 ℃溫水表面展平，然后用防脫載玻片撈起，并放進60 ℃烘箱內(nèi)烘烤，最后將烘好的切片室溫保存?zhèn)溆?。將制作好的石蠟切片進行HE染色及天狼星紅染色。HE染色：常規(guī)脫蠟后切片置于Harris蘇木素染色劑中染色10 min，1%鹽酸酒精分化30 s，自來水中充分洗滌藍化10 min，1%伊紅水溶液染色10 min，自來水沖洗1 min。天狼星紅染色：切片脫蠟后放入天狼星紅飽和苦味酸液中1 h，自來水洗5 min，Mayer蘇木素染液復(fù)染細胞核1 min，自來水洗10 min。染色完成的切片酒精逐級脫水，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察并攝片。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況及創(chuàng)面情況 生理鹽水組：照射后10 d開始出現(xiàn)尾根部及足底輕度紅腫，逐漸加重；15 d尾根部皮膚及足底部出現(xiàn)微小潰瘍，伴有少量滲出，隨后微小潰瘍逐漸加大加深，尾根部皮膚潰瘍成斑片狀，大鼠進食減少，伴有躁狂狀態(tài)；30 d創(chuàng)面達高峰，之后創(chuàng)面愈合很慢，且有擴大趨勢；50 d潰瘍周圍可見少許新生皮膚，生長緩慢；60 d潰瘍未完全收口。 加味四妙勇安油組：照射后14 d出現(xiàn)尾根部及足底輕度紅腫，之后紅腫有加重趨勢；21 d尾根部皮膚出現(xiàn)微小潰瘍，足底部紅腫明顯，大鼠拒絕觸碰，之后皮膚潰瘍增大，局部呈斑片狀；35 d局部潰瘍周圍出現(xiàn)少許新生組織；45 d大鼠進食有所恢復(fù)，新生皮膚逐漸增多；60 d表面基本覆蓋新生皮膚。復(fù)方維生素B12組：照射后10 d可見尾根部及足底輕度紅腫，之后紅腫逐漸加重；18 d大鼠尾根部皮膚及足底部出現(xiàn)微小潰瘍，隨后潰瘍逐漸加深加大，伴有滲出，大鼠拒絕觸碰，局部潰瘍呈斑片狀；30 d創(chuàng)面達高峰，未繼續(xù)擴大；45 d潰瘍周圍出現(xiàn)皮膚新生組織；60 d大鼠皮膚潰瘍未完全收口，新生皮膚增多，但未完全覆蓋。

2.2各組大鼠創(chuàng)面發(fā)生率比較 照射后8 d各組大鼠均未發(fā)生創(chuàng)面；照射后15 d、30 d、45 d、60 d，加味四妙勇安油組和復(fù)方維生素B12組創(chuàng)面發(fā)生率均明顯低于同期生理鹽水組(P均<0.05)，且加味四妙勇安油組均明顯低于復(fù)方維生素B12組(P均<0.05)，但照射后45 d、60 d 3組間整體比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組急性放射性皮炎大鼠照射后不同時間創(chuàng)面發(fā)生率比較

2.3各組大鼠皮膚組織HE染色形態(tài) HE染色細胞核呈藍紫色，細胞漿、基底膜、膠原纖維、肌纖維呈不同程度紅色。 照射后8 d、15 d、30 d，生理鹽水組大鼠皮膚組織中有較多淋巴細胞浸潤，且有較多損傷細胞，即胞質(zhì)紅染、核固縮、核碎裂、核溶解等，炎癥細胞于照射后30 d達到高峰，其后組織緩慢修復(fù)；加味四妙勇安油組和復(fù)方維生素B12組淋巴細胞浸潤和損傷細胞明顯較少，其中加味四妙勇安油組組織損傷程度更小且修復(fù)更快。 見圖1。

圖1 各組急性放射性皮炎大鼠照射后不同時間皮膚組織HE染色形態(tài)(×200)

2.4各組大鼠皮膚組織天狼星紅染色形態(tài) 天狼星紅染色普通光鏡下觀察膠原纖維呈紅色，細胞核呈黃綠色。生理鹽水組整體膠原纖維排列紊亂，可見部分斷裂，組織損傷恢復(fù)緩慢；加味四妙勇安油組和復(fù)方維生素B12組膠原纖維排列較同期生理鹽水組整齊，細胞核更飽滿，形態(tài)更完整，組織損傷恢復(fù)較生理鹽水組快。見圖2。

圖2 各組急性放射性皮炎大鼠照射后不同時間皮膚組織天狼星紅染色形態(tài)(×200)

3 討 論

放射性皮炎的發(fā)生機制在細胞方面主要是放射線損傷基底層細胞，基底層細胞作為表皮干細胞，損傷后無法不斷分裂增殖形成表皮的各層細胞，最終導(dǎo)致放射性皮膚損傷；在分子生物學方面主要是電離輻射可產(chǎn)生大量自由基，使體內(nèi)脂質(zhì)與蛋白質(zhì)氧化、大分子斷裂，細胞因子異常表達，抗氧化酶表達不足，繼而導(dǎo)致細胞死亡[9]。西醫(yī)治療主要是抗氧化、補充生長因子、抗菌抗感染、使用通過營造濕性環(huán)境促進愈合的藥物等，但效果不理想[10]。

中醫(yī)學將放射線歸于“燥熱邪氣”，將放射性皮炎歸于“燒燙傷”“瘡瘍”等疾病范疇[11]。該病病機為機體感受放射線熱毒燥邪，輻射火毒蘊于衛(wèi)分肌表，火熱而燥，燥勝則干，可致局部瘙癢、紅腫熱痛、脫屑等；隨后熱毒循經(jīng)入里，邪熱灼傷營血分，皮膚可熱盛肉腐、潰瘍甚至出血。日久郁熱存里、耗氣傷津，局部皮膚氣血經(jīng)絡(luò)凝滯阻塞，肌膚失于氣血陰津榮養(yǎng)，從而導(dǎo)致局部皮膚干燥粗糙甚至纖維化。加之癌病素體痰凝、氣結(jié)、瘀痹等病理產(chǎn)物，內(nèi)外邪毒相合，病程纏綿難愈，從而嚴重影響放療進程。因此針對放射性皮炎，可從衛(wèi)氣營血方面辨證施治，多選用清熱解毒、去腐生肌、活血散瘀止痛的中藥。古方四妙勇安方對于熱毒壅盛的血管及皮膚病變具有悠久的歷史驗效，其首載于《石室秘錄》：“金銀花二兩，當歸二兩，生甘草一兩，玄參三兩煎湯。日用一劑，七日仍服，瘡口始能收斂而愈。”《驗方新編》[12]中記載四妙勇安湯治脫骨疽:“初生或白色痛極，或如粟米起一黃泡。其皮或如煮熟紅棗，黑色不退，久則潰爛，節(jié)節(jié)脫落，延至手足背腐爛黑陷，痛不可忍……再用金銀花、玄參各三兩，當歸二兩，甘草一兩，水煎服?！贝朔絻H四味藥，但量大效專，清代醫(yī)家鮑相墩言“一連十劑，永無后患”?，F(xiàn)代國醫(yī)大師禤國維善于運用四妙勇安湯加減治療各種皮膚病，尤其是變應(yīng)性血管炎、蕁麻疹性血管炎、過敏性紫癜等皮膚血管炎，療效顯著[13]?，F(xiàn)代研究認為四妙勇安湯具有抗炎、穩(wěn)定斑塊、降低血脂、保護血管、改善血液流變學、抗凝、抗血栓形成、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛的藥理作用，廣泛應(yīng)用于內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、心血管疾病、皮膚疾病、婦科疾病、風濕免疫疾病等[14]。有網(wǎng)絡(luò)藥理學研究篩選出20條通路驗證四妙勇安湯多成分、多靶點、整體調(diào)節(jié)的作用特點，預(yù)測了四妙勇安湯在血管新生中的主要作用機制[15]。

加味四妙勇安油是對四妙勇安湯進行方藥加減以及劑型調(diào)整而制成，根據(jù)用藥經(jīng)驗甄選加入生黃芪、紫草、連翹、蒲公英、冰片。黃芪對機體免疫系統(tǒng)具有一定的調(diào)控作用，黃芪多糖干預(yù)免疫低下小鼠可提高巨噬細胞吞噬指數(shù)、吞噬率，而黃芪中黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、抗病毒、神經(jīng)保護等多種藥理作用[16]。紫草具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[17]，其主要成分紫草素可通過調(diào)控血液氧化還原穩(wěn)態(tài)，緩解血熱證小鼠高熱、出血瘀血、血液氧化損傷，從而發(fā)揮清熱涼血作用[18]。有網(wǎng)絡(luò)藥理學研究發(fā)現(xiàn)黃芪-紫草藥對可以通過多成分多靶點發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、抗細胞凋亡、促進細胞增殖及血管生成、免疫調(diào)節(jié)等作用[19]。連翹善清熱解毒、消癰散結(jié)，被譽為“瘡家圣藥”，如《神農(nóng)本草經(jīng)》中描述連翹“主寒熱，鼠痿，瘰疬，癰腫惡瘡，癭瘤，結(jié)熱”。實驗研究表明連翹苷可減輕炎癥反應(yīng)，促進肛周膿腫大鼠創(chuàng)面血管新生，并推測其作用機制與激活JAK2/STAT3通路有關(guān)[20]。《本草正義》中記載：“蒲公英，其性清涼，治一切疔瘡、癰瘍、紅腫熱毒諸證，可服可敷，頗有應(yīng)驗，而治乳癰乳癤，紅腫堅塊，尤為捷效。”現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)蒲公英有抑菌、 抗氧化、抗炎、抗腫瘤、胃腸保護等作用[21]。冰片外用可清熱涼血、抗炎，且冰片作為早期的天然透皮吸收促進劑可增加多種藥物的透皮量[22]。

本實驗結(jié)果表明，加味四妙勇安油在延緩大鼠急性放射性皮炎創(chuàng)面發(fā)生、減輕創(chuàng)面嚴重程度、促進創(chuàng)面愈合方面的效果均優(yōu)于復(fù)方維生素B12溶液、生理鹽水。分析原因為加味四妙勇安油直接作用于創(chuàng)面后對創(chuàng)面形成保護層，減少空氣與創(chuàng)面的接觸，減少日常污染源，預(yù)防感染，且藥物有效成分經(jīng)皮膚組織充分吸收，從而起到預(yù)防、延緩創(chuàng)面發(fā)生、發(fā)展的作用。本實驗結(jié)果進一步為加味四妙勇安油的臨床應(yīng)用提供了客觀依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。