李炳男，郭斐斐，劉 婧，牛凡紅，王思農(nóng)

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

痤瘡是累及毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病，好發(fā)于顏面部，青春期人群更為常見，嚴(yán)重程度不一[1-2]。臨床上常表現(xiàn)為不同程度的皮膚損傷，如黑頭或白頭粉刺、丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)等，且易反復(fù)發(fā)作，愈后易遺留色素沉著或瘢痕[3]，這不僅影響美觀，還會(huì)對(duì)患者的心理、社交造成不良的影響[4]。目前西醫(yī)臨床治療痤瘡主要采用維A酸類和激素類等藥物,療效確切，但長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生耐藥性、復(fù)發(fā)率高等問題。中醫(yī)藥的治療優(yōu)勢(shì)被越來越多的患者所認(rèn)可，研究證實(shí)部分中藥有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抑制皮脂分泌、抗炎等作用[5]。本實(shí)驗(yàn)觀察了三黃凝膠對(duì)耳郭痤瘡大鼠血清中白細(xì)胞介素-17(IL-17)、白細(xì)胞介素-23(IL-23)水平的影響，旨在探討三黃凝膠治療痤瘡的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)Wistar大鼠50只，體重(180±20)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(甘)2005-001。常規(guī)飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，給固定配方的標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)環(huán)境后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019-116)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 三黃凝膠 (3.6 g生藥/10 g，窯街煤電集團(tuán)有限公司總醫(yī)院， 批號(hào)：Z20160001)；0.025 %維A酸乳膏(商品名：迪維，重慶華邦制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H50021817，規(guī)格：15 g/支)；煤焦油 (廣東恒健制藥有限公司提供，批號(hào):H44024241)；大鼠血清ELISA IL-17和IL-23試劑盒 (南京建成生物工程研究所)。

1.3主要儀器 DW-8W118S低溫保存箱(無錫冠亞恒溫制冷技術(shù)有限公司)，iMark酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂有限公司)，D3024R臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)SCILOGEX賽洛捷克)，DP72雙目倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)，PRACTUM612-1CN電子天秤(德國(guó)) 。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將 50只大鼠按體重由輕到重的順序依次編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)取8只作為空白組，剩余42只大鼠進(jìn)行造模：在右耳內(nèi)側(cè)面的耳導(dǎo)管開口處，約2 cm×2 cm的范圍，用玻璃棒涂煤焦油，每日1次，每次約0.5 mL，連續(xù)涂抹21 d，隔日于鼠耳皮下注射痤瘡丙酸桿菌菌液，每單耳0.1 mL。然后隨機(jī)抽取2只造模大鼠，取耳部痤瘡病變皮膚活檢，用10 %福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片、HE染色。參照痤瘡模型鏡下組織學(xué)觀察的判定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]，以光鏡下皮膚角質(zhì)層增厚，角栓堵塞、擴(kuò)大呈壺狀，毛囊口漏斗部見中量角化物質(zhì)提示大鼠耳郭痤瘡模型建成。將建模成功的40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組8只。模型組不予涂擦任何藥物；各干預(yù)組依據(jù)人與大鼠之間的用藥劑量等效換算公式計(jì)算給藥劑量，維A酸乳膏組給予0.025%維A酸乳膏5 g/(kg·d)右耳郭造模處涂擦，三黃凝膠低、中、高劑量組分別給予含生藥0.02 g/(kg·d)、0.04 g/(kg·d)、0.08 g/(kg·d)的三黃凝膠右耳郭造模處涂擦，均每天1次，連續(xù)4周。

1.5觀察指標(biāo)及方法 造模和干預(yù)期間觀察各組大鼠耳部皮損情況。末次用藥24 h后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，心臟取血5 mL，4 000 r/min離心5 min后取上清液，-80 ℃冰箱中備用，嚴(yán)格按照IL-17、IL-23的ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清中IL-17、IL-23水平。頸椎脫臼法處死大鼠，切取患處耳部組織，用10 %福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察組織病理情況。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠造模期間耳部皮損變化 空白組大鼠耳郭外觀呈淡紅色，可清晰地看到毛細(xì)血管的分布，觸之柔軟，無紅腫現(xiàn)象，內(nèi)耳導(dǎo)管的開口處無角化物質(zhì)分泌。各造模組大鼠造模結(jié)束后，耳郭皮膚色紅，伴有腫脹，觸之皮溫升高，可見明顯表皮增厚，且質(zhì)地粗糙，有較嚴(yán)重的脫屑、痂皮癥狀，毛囊孔增大。

2.2各組大鼠干預(yù)期間耳部皮損變化 空白組大鼠與之前相同。模型組大鼠皮損未見明顯好轉(zhuǎn)。干預(yù)1周后，各干預(yù)組大鼠耳郭皮膚癥狀開始減輕，顏色較前變淡，觸之質(zhì)地變軟，皮溫有所下降，表皮厚度變薄，部分痂皮也開始脫落。干預(yù)4周后，三黃凝膠低劑量組大鼠耳表皮增厚有所減輕，毛囊角栓和結(jié)節(jié)明顯減少，但仍有較多未治愈粉刺存在；三黃凝膠中劑量組大鼠耳表皮厚度正常，毛囊角栓和結(jié)節(jié)顯著減少，但仍有少量脫屑現(xiàn)象；三黃凝膠高劑量組大鼠耳皮膚顏色接近正常，皮溫正常，觸之質(zhì)地柔軟、無腫脹，無脫屑及痂皮現(xiàn)象，基本恢復(fù)正常狀態(tài)；維A酸乳膏組大鼠皮損恢復(fù)狀態(tài)與三黃凝膠中劑量組相近。

2.3各組大鼠血清IL-17、IL-23水平比較 模型組大鼠血清IL-17、IL-23水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；各干預(yù)組大鼠血清IL-17、IL-23水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且三黃凝膠高劑量組均明顯低于維A酸乳膏組(P均<0.05)，三黃凝膠低、中劑量組與維A酸乳膏組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和耳郭痤瘡各組大鼠血清IL-17、IL-23水平比較

2.4各組大鼠耳組織病理學(xué)表現(xiàn) 光鏡下觀察，空白組大鼠耳組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列有序，表皮組織較薄，毛囊、皮脂腺清晰可見，角化無異常；模型組大鼠耳表皮組織增厚，皮脂腺增大，毛囊擴(kuò)大成壺狀，同時(shí)致密的角化物質(zhì)充滿了毛囊口和漏斗部；三黃凝膠低劑量組毛囊口擴(kuò)張程度有所減輕，其內(nèi)角化物疏松，炎性細(xì)胞較模型組減少；三黃凝膠中劑量組和維A酸乳膏組可見毛囊口擴(kuò)張程度減輕，炎性細(xì)胞減少，表皮略微增厚；三黃凝膠高劑量組炎性細(xì)胞顯著減少，表面附有薄層角質(zhì)層。見圖1。

圖1 正常組和耳郭痤瘡各組大鼠耳組織HE染色病理表現(xiàn)(×100)

3 討 論

痤瘡的病因尚不明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為與皮膚的炎性反應(yīng)密切相關(guān)[7-8]。Th17是誘導(dǎo)炎性發(fā)生的重要細(xì)胞，IL-17和IL-23是Th17細(xì)胞發(fā)揮作用的主要相關(guān)細(xì)胞因子，Th17細(xì)胞通過IL-23/IL-17炎癥軸，在自身免疫性疾病及炎性疾病中發(fā)揮重要作用[9-10]。IL-17 是T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子，能夠募集和激活單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞在炎性部位聚集[11]，增加細(xì)胞滲透性，并誘導(dǎo)炎性反應(yīng)[12]。同時(shí)IL-17有強(qiáng)大的致炎性，可誘導(dǎo)其他促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，并促進(jìn)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[13]，加重局部組織的炎性反應(yīng)。IL-23是由活化的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞分泌的促炎因子[14]，可以通過誘導(dǎo)、驅(qū)動(dòng)Th17細(xì)胞的分化，以產(chǎn)生IL-6、IL-17和IFN-γ，從而引起炎癥細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15-16]。IL-23本身還可以通過記憶T細(xì)胞的擴(kuò)增產(chǎn)生大量巨噬細(xì)胞來促進(jìn)單核細(xì)胞分化，與IL-1一起參與炎癥反應(yīng)[17-18]。IL-17誘導(dǎo)、刺激產(chǎn)生的前炎性因子(IL-1、IL-6等)可進(jìn)一步引起IL-23的過表達(dá)。因此，IL-17、IL-23可能在痤瘡的發(fā)病中起著重要作用。

中醫(yī)認(rèn)為痤瘡可因素體陽熱偏盛，肺經(jīng)蘊(yùn)熱，復(fù)受風(fēng)邪，亦可由于后天失養(yǎng)，嗜食辛辣肥甘厚味，濕熱互結(jié)以及失眠熬夜、酗酒吸煙等不良生活習(xí)慣，導(dǎo)致肺胃火熱熏蒸顏面，誘發(fā)本病[19]。本實(shí)驗(yàn)選用的三黃凝膠是在三黃膏的基礎(chǔ)上改變劑型得來的。三黃膏是治療痤瘡的傳統(tǒng)中醫(yī)外用制劑，主要組成有黃連、黃芩、黃柏、冰片、麻油和凡士林等。由于傳統(tǒng)加工工藝簡(jiǎn)單，使之存在有效成分析出有限、吸收較慢、用藥后色素沉著的問題。因此，三黃凝膠新增具有美白功效的茯苓、白及、白芷等藥物，再結(jié)合現(xiàn)代制劑工藝，將卡波姆作基質(zhì)并加入促透劑(月桂氮酮)、調(diào)節(jié)劑(三乙醇胺)，使之透皮吸收快、顯效快，色素沉著減少，更易涂抹，攜帶方便，更易被患者所接受。方中黃芩、黃柏、黃連為君藥，具有清熱解毒消腫的功效，且黃芩內(nèi)含黃酮類物質(zhì)，可以抑制炎性介質(zhì)釋放[20]，從而達(dá)到抗炎的效果，黃芩苷可減輕細(xì)胞過多地分泌雄性激素，有效防止復(fù)發(fā)；黃連中的小檗堿成分有很好的抗菌活性，同時(shí)也能有效抑制急慢性炎癥[21]?？鄥ⅰ?dāng)歸、丹參為臣藥，苦參有祛風(fēng)逐濕之功，能助三黃之藥效；丹參有涼血消腫、祛瘀祛瘢之功，且丹參有抑制真菌繁殖、減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)組織修復(fù)與再生的作用[22]；當(dāng)歸有活血養(yǎng)血之功，且化瘀而不傷血，還可增強(qiáng)機(jī)體的特異性及非特異性免疫功能[23]；白芷、白及、茯苓為佐藥，均具有消腫功效，同時(shí)白芷可抑制黑素細(xì)胞合成，減少色素沉著[24]；白及可作為天然的乳化劑，可誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，白及膠漿有較強(qiáng)的抑菌作用，易在局部形成保護(hù)膜[25-26]；薄荷、冰片為使藥，能引藥直達(dá)病所，以助三黃散毒去瘡。全方共奏清熱解毒、消腫止痛、活血化瘀之功。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，痤瘡模型大鼠血清IL-17、IL-23水平明顯高于空白組，提示IL-17、IL-23在痤瘡的發(fā)病中起著重要作用。干預(yù)結(jié)束后，三黃凝膠低劑量組大鼠仍有較多未治愈粉刺，三黃凝膠中、高劑量組和維A酸乳膏組大鼠痤瘡皮損均明顯減輕，三黃凝膠高劑量組基本恢復(fù)正常且鏡下僅見少量炎性細(xì)胞；各干預(yù)組大鼠血清IL-17、IL-23水平均較模型組低，其中三黃凝膠高劑量組均明顯低于其他組。提示三黃凝膠可有效治療痤瘡， 推測(cè)其可能通過抑制IL-17、IL-23的分泌，控制炎性反應(yīng)從而發(fā)揮作用，也說明通過抑制IL-17、IL-23治療痤瘡是可行的。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。