陳敏純， 張婧一， 張雨晨， 葉 丹， 閆抗抗， 劉生元

(西北大學(xué)附屬醫(yī)院/西安市第三醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710018)

缺血性腦卒中嚴(yán)重危害人類健康，其致病率、死亡率在全球居首位[1]。由于其病理機(jī)制復(fù)雜，迄今尚無理想的治療藥物和措施。尋找安全、療效顯著、作用機(jī)制確切的腦卒中防治藥物成為治療該疾病的迫切需求。目前，以抗氧化應(yīng)激為靶點(diǎn)治療缺血性腦卒中的藥物研究日趨成為醫(yī)藥領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α/Nrf2是抗腦缺血損傷和神經(jīng)退行性疾病的重要生存通路，PGC-1α/Nrf2通路參與調(diào)控氧化應(yīng)激功能累及的多種因子、多個(gè)環(huán)節(jié)的復(fù)雜反應(yīng)從而挽救神經(jīng)元損傷[2-3]。鞣花酸是一種多酚物質(zhì)，廣泛存在于石榴、赤芍、柯子等食藥中，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡作用[4-5]，課題組前期研究證實(shí)它具有抗動(dòng)脈粥樣硬化血管保護(hù)作用[6]，但能否調(diào)控PGC-1α/Nrf2信號(hào)通路，抑制氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用尚不清楚。本研究以大鼠中動(dòng)脈栓塞為缺血性腦卒中模型(MCAO)，考察鞣花酸對(duì)缺血性腦卒中抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，并探討其調(diào)控機(jī)制，為將其開發(fā)成新型安全防治缺血性腦卒中藥物提供理論依據(jù)，同時(shí)揭示相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器、藥物與試劑 脫水機(jī)、組織攤烤片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，JT-12J、JK-6)；病理切片機(jī)(德國(guó)Leica公司，RM2016)；顯微鏡(日本奧林巴斯公司，BX53型)；離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，HI650)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo scientific公司，Multiskan MK3)；蛋白免疫印跡系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。鞣花酸(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Roche Applied Science公司)；抗熒光淬滅封片劑(美國(guó)Southernbiotech公司)；DAPI(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；CD34(英國(guó)Abcam公司)；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)測(cè)試試劑盒(南京建成生物工程研究所)；PGC-1α抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；Nrf2抗體(美國(guó)Affinity公司)。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，8～10周齡，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK-(陜)-2014-002。大鼠自由取食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)，40只大鼠隨機(jī)分為5組，即正常組、模型組、鞣花酸低劑量組(50 mg/kg)、鞣花酸中劑量組(100 mg/kg)、鞣花酸高劑量組(150 mg/kg)，每組8只。正常組不插入線栓，其余操作同模型組，缺血性腦卒中模型制作參考Qiang等[7]報(bào)道，分離大鼠頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)外動(dòng)脈，將線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈約18 mm處，阻塞顱內(nèi)中動(dòng)脈，缺血2 h后取出線栓。應(yīng)用Garcia評(píng)分，按照每項(xiàng)反應(yīng)程度對(duì)清醒后大鼠進(jìn)行1、2、3分評(píng)定，選取1～2分者作為模型。大鼠造模成功后，鞣花酸溶于生理鹽水中每天灌胃給藥1次，連續(xù)7 d，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃。

2.2 神經(jīng)功能評(píng)分 給藥結(jié)束后，大鼠進(jìn)行Garcia評(píng)分，根據(jù)自主運(yùn)動(dòng)情況、提起鼠尾懸空時(shí)四肢活動(dòng)的對(duì)稱情況、前爪伸展情況、攀爬和抓持鐵網(wǎng)的能力、身體感覺反應(yīng)、觸碰胡須的反應(yīng)，按照程度進(jìn)行1、2、3分評(píng)定。

2.3 腦梗死體積檢測(cè) 神經(jīng)功能評(píng)分后，麻醉大鼠，斷頭取腦，沿冠狀面進(jìn)行切片(厚度約2 mm)，浸泡于TTC中，孵育30 min后多聚甲醛固定2 h，計(jì)算腦梗死面積。

2.4 腦組織病理學(xué)觀察 大鼠腦組織塊進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋及切片處理，采用蘇木素染色5 min，1%水溶性伊紅染液染色2 min，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿、肌纖維、膠原纖維和紅細(xì)胞呈不同程度的紅色，照相倍數(shù)為200倍。

2.6 在體細(xì)胞凋亡檢測(cè) 大鼠腦組織塊進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋、切片處理后，滴加蛋白酶K工作液反應(yīng)30 min，PBS洗滌3次后加入50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，37 ℃避光孵育60 min，再滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核。熒光顯微鏡下觀察組織切片上凋亡的細(xì)胞呈紅色熒光，藍(lán)色為細(xì)胞核，照相倍數(shù)為400倍。

2.7 腦組織中PGC-1α、Nrf2蛋白表達(dá)檢測(cè) 提取腦組織蛋白并進(jìn)行蛋白濃度定量，配制電泳膠，用微量加樣器將制備好的蛋白樣品和MAKER加入上樣孔，各樣品總蛋白量為40 μg，進(jìn)行電泳分離，切下目的條帶進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜，再將PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃搖床孵育2 h，顯色曝光，用BandScan分析膠片灰度值。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能評(píng)分 正常組大鼠神經(jīng)功能正常，模型組神經(jīng)功能影響最嚴(yán)重，與模型組比較，鞣花酸組神經(jīng)功能改善(P<0.05)，高劑量給藥組神經(jīng)功能優(yōu)于低、中劑量給藥組。如表1所示。

3.2 腦梗死體積 正常組大鼠腦組織無梗死體積，模型組大腦梗死體積最大，高達(dá)(42.28±2.79)%，與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而鞣花酸給藥組腦梗死灶縮小，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，以高劑量組最小，說明鞣花酸對(duì)缺血性腦卒中大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，改善腦神經(jīng)功能，縮小腦梗死灶。如表1所示。

表1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積

3.3 腦組織病理學(xué)變化 正常組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)基本正常，組織致密，細(xì)胞排列整齊，胞核位于細(xì)胞中央；模型組腦組織疏松，腫脹明顯，細(xì)胞數(shù)量減少，排列紊亂，神經(jīng)元胞核固縮，顏色深染；鞣花酸高劑量組病理學(xué)變化較模型組改善。如圖1所示。

圖1 大鼠腦組織HE染色(×200，n=8)Fig.1 Brain tissues of rats by HE staining (×200，n=8)

3.4 氧化應(yīng)激水平 如圖2所示，與正常組比較，模型組MDA水平增高(16.28±1.31)nmol/mL(P<0.05)；而給予鞣花酸藥物處理后，與模型組比較，MDA水平降低(P<0.05)，高劑量組效果最優(yōu)[(12.79±2.31)nmol/mL]，表明鞣花酸具有降低脂質(zhì)過氧化作用。與模型組比較，鞣花酸組增加SOD活性(P<0.05)，高劑量組效果最優(yōu)[(113.565 ±19.23 U/mL)]，說明鞣花酸有抗氧化作用。

注：與模型組比較，*P<0.05；與正常組比較，#P<0.05。圖2 大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平(n=8)Fig.2 Levels of oxidative stress in brain tissues of rats(n=8)

3.5 在體細(xì)胞凋亡 如圖3～4所示，正常組無細(xì)胞凋亡；模型組凋亡指數(shù)最高[(45.23±2.12)%]，凋亡細(xì)胞密集分布；給藥組TUNEL陽(yáng)性凋亡表達(dá)降低(P<0.05)，高劑量組下降至25.31%。

圖3 鞣花酸對(duì)MCAO模型大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響(×400，n=8)Fig.3 Effect of ellagic acid on the number of TUNEL positive cells of MCAO rat models(×400，n=8)

注：與模型組比較，*P<0.05；與正常組比較，#P<0.05。圖4 鞣花酸對(duì)MCAO模型大鼠抗細(xì)胞凋亡的影響(n=8)Fig.4 Effects of ellagic acid on the number of TUNEL positive cells of MCAO rat models(n=8)

3.6 腦組織PGC-1α、Nrf2蛋白表達(dá) 如圖5所示,與正常組比較，模型組PGC-1α、Nrf2蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，而給藥組PGC-1α、Nrf2高于模型組(P<0.05)。

注：與模型組比較，*P<0.05；與正常組比較，#P<0.05。圖5 鞣花酸對(duì)MCAO模型大鼠PGC-1α、Nrf2蛋白表達(dá)影響(n=8)Fig.5 Effects of ellagic acid on the expressions of PGC-1α and Nrf2 proteins in MCAO rat models(n=8)

4 討論

中醫(yī)藥在治療缺血性疾病方面顯示出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，臨床療效確切[8],認(rèn)為瘀血阻滯、熱毒壅盛是缺血性腦卒中的主要病機(jī)，故以行氣營(yíng)血、清熱解毒為主要治法[9]。赤芍性微寒，味苦，有破血行氣、清熱解毒、引血下行的功效。課題組前期從赤芍中分離鑒定出一種有效成分鞣花酸具有抗動(dòng)脈粥樣硬化血管保護(hù)作用，本研究顯示鞣花酸對(duì)缺血性腦卒中大鼠有保護(hù)作用，可顯著改善MCAO模型大鼠的缺血梗死灶，恢復(fù)神經(jīng)功能，緩解缺血灶組織病理學(xué)變化。

腦缺血損傷機(jī)制眾多，至今尚未完全清楚，以往研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激損傷在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。腦缺血缺氧后，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，爆發(fā)的ROS激活了線粒體凋亡通路，同時(shí)使線粒體DNA致突變，轉(zhuǎn)錄有缺陷的電子傳遞鏈組分，導(dǎo)致ROS瀑布式的增長(zhǎng)，加重細(xì)胞凋亡。MDA反映的是ROS與不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)的程度，其有細(xì)胞毒性作用，本研究顯示鞣花酸降低MDA水平。SOD是體內(nèi)清除ROS重要的抗過氧化物酶，緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，鞣花酸增加SOD活性。TUNEL結(jié)果也顯示鞣花酸降低在體細(xì)胞凋亡，且抗凋亡作用呈劑量依賴，表明鞣花酸可調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化應(yīng)激損傷作用。

以往研究證明腦缺血損傷可增加腦組織的PGC-1α表達(dá)，若PGC-1α被抑制則加重腦損傷，表明PGC-1α具有神經(jīng)保護(hù)作用[10]。PGC-1α靶向激活雌激素受體相關(guān)受體(ERR)家族蛋白，ERRα促Nrf2高表達(dá)，激活下游一系列信號(hào)轉(zhuǎn)錄，修復(fù)受損神經(jīng)元細(xì)胞[11]。PGC-1α是線粒體生物合成的重要調(diào)控因子，也是線粒體保護(hù)的重要靶蛋白。神經(jīng)元細(xì)胞中PGC-1α高表達(dá)可增加神經(jīng)元細(xì)胞樹突棘的數(shù)量并促進(jìn)突觸分化[12]。在氧化應(yīng)激條件下，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞PGC-1α表達(dá)能減少線粒體內(nèi)ROS積累，穩(wěn)定線粒體膜電位，減少細(xì)胞凋亡[13]。Han等[14]研究發(fā)現(xiàn)PGC-1α促進(jìn)了線粒體抗氧化劑(SOD、Prx3、GPx1)和解偶聯(lián)蛋白(UCP2、UCP4和UCP5)的表達(dá)，進(jìn)而降低ROS的產(chǎn)生。Nrf2是結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(ARE)的主要轉(zhuǎn)錄因子，激活下游信號(hào)因子ARE，啟動(dòng)抗氧化基因表達(dá)，激活許多維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因，如GSH-Px和SOD抗氧化系統(tǒng)的相關(guān)基因[15]。這些信號(hào)因子參與調(diào)控ROS代謝，蛋白酶體功能等。當(dāng)Nrf2耗竭完，或表達(dá)異常下降，致AER介導(dǎo)抗氧化酶基因表達(dá)失敗[16]。PGC-1α/Nrf2信號(hào)通路是雙向環(huán)路相互作用，ROS解毒系統(tǒng)可誘導(dǎo)PGC-1α高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)顯示，與模型組比較，鞣花酸給藥組增加腦組織PGC-1α、Nrf2表達(dá)，提示它可能為PGC-1α激活劑，其抗氧化應(yīng)激作用通過調(diào)控PGC-1α/Nrf2信號(hào)通路表達(dá)發(fā)揮。

綜上所述，鞣花酸通過激活PGC-1α/Nrf2信號(hào)通路，調(diào)控氧化應(yīng)激，修復(fù)受損神經(jīng)元細(xì)胞，發(fā)揮抗缺血性腦卒中作用。