周蒙恩， 陳懿榕， 張 娜， 晏 旎， 闕任燁， 李 勇

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院 脾胃病科， 上海 200071

肝纖維化是指細(xì)胞外基質(zhì)過多沉積，破壞肝臟的生理結(jié)構(gòu)，是各種慢性肝病(如慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等)的共同結(jié)果[1]。晚期肝纖維化可能進(jìn)展為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化，肝硬化可引起腹水、脾腫大、側(cè)支循環(huán)形成、上消化道出血，甚至導(dǎo)致死亡[2]。NLRP3炎性體是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與多種炎性疾病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，在丙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝炎、肝纖維化、肝臟缺血/再灌注損傷等急慢性肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中都存在著NLRP3炎性體的活化[3-7]，而在膽管結(jié)扎大鼠中尚未報道。本實驗通過膽總管結(jié)扎(bile duct ligation, BDL)造成大鼠膽汁淤積性肝纖維化模型，觀察肝纖維化過程中NLRP3炎性體的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD成年大鼠，65只，體質(zhì)量180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(滬)2012-0002，實驗動物使用許可證編號：SYXK(滬)2020-0014，自由進(jìn)食飲水，恒溫 (25±2)℃，恒濕，12 h/d，明暗交替。

1.2 試劑和儀器 NLRP3抗體(Cell Signaling Technology，美國)，ASC抗體、caspase1抗體(Novus Biologicals, 美國)，β-actin抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，IL-1β ELISA 檢測試劑盒(Thermo Fisher Scientific， 美國)，TGFβ1、α平滑肌肌動蛋白(αSMA)免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)，蘇木素-伊紅染色液(湖南艾佳生物科技股份有限公司)，Masson染色液(北京索萊寶科技有限公司)，天狼星紅染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)，RT-PCR引物(上海生工生物工程有限公司)。天能EPS300電泳儀(上海天能科技有限公司)，RM2016切片機(jī)(萊卡公司)，多功能酶標(biāo)儀(Thermo, 美國)，Nanodrop2000(Thermo, 美國)，S1000 PCR儀(BIO-RAD，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及模型建立 將65只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組，假手術(shù)組15只，模型組50只，模型組行BDL，假手術(shù)組僅開腹并游離膽總管后關(guān)腹。造模方法參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，分別于第3、7、14、21、28天，處死10只模型組，同時處死3只假手術(shù)組。動物處死后取血清、肝組織標(biāo)本備用。肝組織標(biāo)本保存于-80 ℃中，部分標(biāo)本用中性福爾馬林固定12 h后經(jīng)石蠟包埋，3～5 μm厚連續(xù)切片備檢。

1.3.2 肝功能指標(biāo) 用全自動生化分析儀檢測血清AST、ALT、ALP、DBil、TBA、TBil水平。

1.3.3 肝臟病理組織檢查 病理組織學(xué)采用HE染色、Masson染色、天狼星紅-苦味酸染色3種染色方法，取備檢石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、染色、分化、透明、封片、鏡檢，分別觀察病變與纖維化程度。肝纖維化評分標(biāo)準(zhǔn)參照《肝纖維化診斷及治療共識(2019年)》[9]。

1.3.4 免疫組化檢測αSMA及TGFβ1表達(dá) 石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化，抗原修復(fù)冷卻后，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性, 血清封閉，孵育一抗、孵育二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明后封片、鏡檢，用Image-Pro Plus 6.0 軟件對肝組織陽性表達(dá)面積進(jìn)行半定量分析。

1.3.5 Western Blot檢測NLRP3炎性體表達(dá)

取大鼠肝臟組織裂解后，提蛋白，以SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，12%分離膠)進(jìn)行電泳分離膠分離蛋白，并通過半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PVDF膜經(jīng)5%的脫脂奶粉搖床上慢搖2 h封閉，分別與NLRP3抗體、ASC抗體、caspase1抗體4 ℃過夜，室溫孵育二抗2 h，ECL光化學(xué)顯色。最后應(yīng)用Image J分析軟件對掃描條帶進(jìn)行定量分析，計算各蛋白相對表達(dá)量。

1.3.6 RT-PCR檢測NLRP3、ASC、caspase1炎性體表達(dá)

取大鼠肝臟組織加入Trizol研磨離心取上清，提取總RNA，Nanodrop2000檢測RNA的純度和濃度，各組取2 μl總RNA，按20 μl總反應(yīng)體積，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。NLRP3上游引物 5′- GCTGCGATCAACAGGCGAGAC-3′，下游引物5′- AAGGCTGTCCTCCTGGCATACC-3′；ASC上游引物5′-ACAATGACTGTGCTTAGAGACA-3′，下游引物5′-CACAGCTCCAGACTCTTCTTTA-3′；caspase1上游引物5′-AGAGGATTTCTTAACGGATGCA-3′，下游引物5′-TCACAAGACCAGGCATATTCTT-3′；β-actin上游引物5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′，下游引物5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′。采用三步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，得到各樣本 CT值，然后利用2-△△Ct計算各組基因的相對表達(dá)量。

1.3.7 ELISA檢測IL-1β水平 取肝組織，置于含RIPA裂解液的離心管中裂解蛋白，4 ℃條件下離心，取上清液。按 ELISA 試劑盒說明書操作步驟檢測各組肝組織IL-1β水平。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由上海市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，批號： SZY2017018，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 BDL大鼠血清肝功能檢測 BDL模型組大鼠自BDL術(shù)后血清肝功能各檢測指標(biāo)顯著提高，并于第3天達(dá)最大值(P值均<0.05)；第7～28天各指標(biāo)較3天組下降，但與假手術(shù)組相比仍有升高(P值均<0.05)(表1)。

2.2 大鼠肝臟組織HE染色 假手術(shù)組無炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞多，肝小葉結(jié)構(gòu)完整；第3天和第7天BDL組可見匯管區(qū)少量炎細(xì)胞浸潤，肝小葉間膽管增生，中央靜脈與肝血竇輕度擴(kuò)張淤血；第14天起可見匯管區(qū)纖維組織增生，肝小葉間膽管明顯增生，部分分割包繞肝小葉使其結(jié)構(gòu)紊亂，第28天肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，被沉積的膠原分割成大量假小葉(圖1)。

注：a，假手術(shù)組；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

2.3 大鼠肝臟組織Masson染色 假手術(shù)組肝組織、肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索呈放射狀排列；膽總管結(jié)扎3 d后可見少量膠原纖維在匯管區(qū)和中央靜脈分布；第7天匯管區(qū)、肝竇擴(kuò)大，纖維組織增生，沿匯管區(qū)、中央靜脈向外延伸；第14天匯管區(qū)、肝竇區(qū)、中央靜脈纖維組織增生，面積較前擴(kuò)大；第21天大鼠肝組織膠原纖維帶明顯；第28天可見肝細(xì)胞脂肪樣變，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維條索更加粗大明顯，部分互相連接(圖2)。

注：a，假手術(shù)組；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

2.4 大鼠肝臟組織苦味酸-天狼星染色 假手術(shù)組在中央靜脈壁和匯管區(qū)間見極少量膠原纖維，膽總管結(jié)扎3d后匯管區(qū)可見膠原纖維增生沉積較假手術(shù)組增多，隨著膽管結(jié)扎時間逐漸延長，肝纖維化程度持續(xù)增加，肝內(nèi)膠原沉積在增生的膽管上皮細(xì)胞周圍，以匯管區(qū)為中心向肝實質(zhì)延伸，增生的小膽管及其周圍的膠原纖維形成間隔，部分與臨近的增生間隔相互連接、包繞、分割，形成假小葉(圖3)。

注：a，假手術(shù)組；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

2.5 免疫組化檢測αSMA及TGFβ1在大鼠肝組織中的表達(dá) 結(jié)果顯示，假手術(shù)組僅在血管壁平滑肌見少量αSMA表達(dá)；BDL第3天，αSMA在血管壁表達(dá)明顯；第7天匯管區(qū)的膽管壁亦見αSMA表達(dá)、棕黃色顏色加深；第14天αSMA表達(dá)較前明顯增多，呈長橢圓形；第21、28天在匯管區(qū)、纖維間隔區(qū)αSMA蛋白沉積明顯、αSMA陽性表達(dá)的面積增大，染色明顯加深(圖4)。假手術(shù)組大鼠肝組織中可見少量TGFβ1表達(dá)，主要在肝組織的間質(zhì)細(xì)胞；BDL第3、7天，大鼠肝組織中匯管區(qū)TGFβ1表達(dá)，呈棕黃色胞漿型分布；第14天，TGFβ1表達(dá)明顯增強，數(shù)目增多，匯管區(qū)和纖維隔中染色明顯加深，呈斑片狀彌漫性分部(圖5)。

注：a，假手術(shù)組；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

注：a，假手術(shù)組；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

2.6 免疫組化半定量及肝纖維化程度評分 結(jié)果提示，免疫組化半定量中，除BDL第3天外，各組與假手術(shù)組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，且隨時間延長αSMA、TGFβ1表達(dá)強度增加；肝纖維化評分比較，各組與假手術(shù)組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，且隨時間延長肝纖維化程度增加(表2)。

表2 免疫組化半定量及肝纖維化評分

2.7 NLRP3炎性體蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，除BDL3 d組NLRP3外，余組NLRP3炎性體(NLRP3、ASC、caspase1)蛋白表達(dá)均增加(P值均<0.05)，隨時間延長，BDL14 d前組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，第14天后增高趨于平穩(wěn)(圖6，表3)。

表3 NLRP3炎性體蛋白表達(dá)

圖6 大鼠肝組織NLRP3炎性體蛋白表達(dá)情況

2.8 NLRP3炎性體mRNA表達(dá) 與假手術(shù)組比較，各組NLRP3炎性體(NLRP3、ASC、caspase1)mRNA表達(dá)均增加(P值均<0.05)，隨時間延長，BDL14 d前組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)，14天后增高趨于平穩(wěn)(表4)。

表4 NLRP3炎性體mRNA表達(dá)

2.9 肝組織IL-1β水平 IL-1β在造模后第3天明顯增高，并達(dá)到最高值，第7～28天各指標(biāo)較第3天下降，但與假手術(shù)組相比仍有升高(P值均<0.05)(表5)。

表5 各組肝組織IL-1β水平

3 討論

BDL是制作肝纖維化動物模型的經(jīng)典方法，可導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死及肝纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化[1,9]。膽總管結(jié)扎急性期為3 d，慢性期超過10 d，急性期主要是炎癥開始及免疫細(xì)胞浸潤，慢性期主要是免疫細(xì)胞浸潤、炎癥和晚期纖維化的變化導(dǎo)致疾病進(jìn)展[10]。肝臟受傷后，肝星狀細(xì)胞被激活分化為產(chǎn)生膠原的肌成纖維細(xì)胞，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生，是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[11-12]。而αSMA的表達(dá)是肝星狀細(xì)胞活化的重要標(biāo)志[13-14]，TGFβ1是參與肝纖維化過程中影響肝星狀細(xì)胞活化的最有效介質(zhì)[15]，它通過刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成和抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，在將靜止的肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為纖維化的肌成纖維細(xì)胞過程中起著至關(guān)重要的作用[16]。NLRP3炎性體主要是由NLRP3、ASC、caspase1三者相互作用，形成的一個同心的組織，其中ASC層包圍著NLRP3蛋白，而caspase1則附著在外面的ASC層上[17]。NLRP3炎性體是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠識別各種應(yīng)激、外源微生物和內(nèi)源性危險信號，被多種刺激激活[18-19]。NLRP3炎性體被激活后，產(chǎn)生有活性的caspase1，導(dǎo)致IL-1β和IL-18的釋放，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生[20]。近來有研究[21]表明，NLRP3炎癥體在肝星狀細(xì)胞激活中的作用直接引發(fā)了肝纖維化。

有研究[22-25]顯示，NLRP3炎性體參與慢性阻塞性肺疾病、糖尿病腎病、心血管疾病、炎性腸病以及自身免疫疾病等的發(fā)生發(fā)展。同時在各種急慢性肝病及肝纖維化中也存在NLRP3的表達(dá)[26]，這將有望成為臨床上治療疾病的新靶點。據(jù)報道NLRP3抑制劑MCC-950可以減輕小鼠實驗性非酒精性脂肪性肝炎中的肝臟炎癥和纖維化[27]，caspase1抑制劑在體內(nèi)抑制NLRP3炎癥小體可顯著降低膽管結(jié)扎小鼠肝組織成熟IL-1β水平，減輕肝纖維化程度[28]。但并沒有實驗說明NLRP3炎性體與肝纖維化的相關(guān)性，以及在肝纖維化形成過程中NLRP3炎性體是否持續(xù)活化。

本研究結(jié)果顯示，BDL大鼠模型第3天處于急性期，血清AST、ALT、ALP、DBil、TBA、TBil、肝組織IL-1β水平明顯升高，其后有所下降，考慮后期由急性期轉(zhuǎn)入慢性，在肝臟的自我修復(fù)功能作用下，肝功能指標(biāo)及IL-1β有所恢復(fù)，但仍不能恢復(fù)到正常水平，隨著時間延長炎癥損傷持續(xù)存在。HE染色、Masson染色、苦味酸-天狼星染色，顯示BDL大鼠模型組隨時間延長，可見炎癥細(xì)胞浸潤，肝小葉間膽管增生，匯管區(qū)纖維組織增生，后期大量假小葉形成，以及膠原纖維沉積持續(xù)增加，肝纖維化程度評分逐漸增加，提示BDL大鼠模型中存在著肝炎-肝纖維化-肝硬化的動態(tài)演變；免疫組化結(jié)果顯示αSMA、TGFβ1 蛋白隨時間延長表達(dá)強度逐漸增加，提示肝纖維化過程持續(xù)加重；BDL大鼠模型組肝組織中NLRP3炎性體蛋白及mRNA表達(dá)漸次增高，14 d后趨于平穩(wěn)，提示在肝纖維化過程中NLRP3炎性體活化持續(xù)存在，考慮到14 d后肝纖維化向肝硬化方向轉(zhuǎn)變，但NLRP3炎性體仍處于高表達(dá)狀態(tài)，說明在肝纖維化-肝硬化過程中NLRP3炎性體亦參與其中，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

以上結(jié)果顯示 BDL大鼠造模后肝臟損傷，病理學(xué)膠原纖維明顯沉積，肝纖維化標(biāo)志物明顯表達(dá)，證實了BDL大鼠模型中存在肝炎-肝纖維化-肝硬化的動態(tài)演變；伴隨著肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，NLRP3炎性體蛋白及基因表達(dá)明顯上調(diào)，并于BDL14 d后處于穩(wěn)定高表達(dá)狀態(tài)，提示在肝炎-肝纖維化-肝硬化演變過程中存在著NLRP3炎性體的持續(xù)活化，可能與其發(fā)揮促進(jìn)纖維化的作用有關(guān)。因此從NLRP3炎性體進(jìn)行研究，探索肝纖維化的機(jī)理，有助于阻斷肝纖維化的產(chǎn)生，阻止病情進(jìn)一步惡化，對臨床肝纖維化的治療及新藥的開發(fā)提供了一定依據(jù)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：周蒙恩、陳懿榕等負(fù)責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；張娜、晏旎、闕任燁等參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；李勇等負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。