徐丹妮 張巍 牛昀

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌中一類高度惡性的分子亞型，患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后較差[1-2]，迫切需要尋找有效的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物[3]。視黃酸受體相關(guān)孤兒受體-γ（retinoic acid receptor-related orphan receptor-γ，ROR-γ）是RORC 基因編碼的一種核受體和轉(zhuǎn)錄因子[4]，參與了細(xì)胞分化、代謝、免疫調(diào)節(jié)等過程，并在前列腺癌、皮膚癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)[5]。在乳腺癌，ROR-γ 的作用尚不明確，并鮮有組織水平蛋白表達(dá)的檢測(cè)與報(bào)道。本研究基于對(duì)乳腺癌公共數(shù)據(jù)庫和TNBC 臨床樣本的檢測(cè)分析，旨在探討ROR-γ 在TNBC 組織中的表達(dá)特點(diǎn)及預(yù)后意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2011年1月至2014年12月收治于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院的269 例乳腺癌患者的組織標(biāo)本和臨床病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）原發(fā)性乳腺癌；2）術(shù)前未行放療、化療等輔助治療；3）病理診斷結(jié)果為TNBC；4）未合并其他系統(tǒng)的惡性腫瘤；5）病歷資料完整。本研究符合本院倫理委員會(huì)的倫理標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)收集 獲取Oncomine 網(wǎng)站（https://www.oncomine.org/resource/login.html）“TCGA Breast，Invasive Ductal and Lobular Carcinomavs.Normal”和“Finak Breast”中的ROR-γ mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)，基因探針A_23_P372910。采用Kaplan-Meier Plotter 網(wǎng)站（http://kmplot.com/analysis/）分析預(yù)測(cè)ROR-γ 在乳腺癌不同分子亞型中的預(yù)后意義，基因探針206 419_at，終點(diǎn)事件為總生存期（overall survival，OS）、無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期（distant metastatic-free survival，DMFS）。設(shè)定雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）的免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)狀態(tài)，及人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）的基因表達(dá)狀態(tài)以細(xì)分乳腺癌分子亞型。

1.2.2 試劑 ROR-γ 抗體（ab268112）購自美國Abcam公司；SP-9 000 通用IHC 試劑盒、DAB 顯色試劑盒、EDTA 抗原修復(fù)液（pH 9.0）購自中國Zsbio 公司；蘇木素染液、中性樹膠購自中國Solarbio 公司。

1.2.3 IHC 檢測(cè) 將組織蠟塊制成4 μm 厚度的組織切片。經(jīng)烤片、脫蠟水化后使用高壓熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)（EDTA 修復(fù)液）。參照SP-9 000 試劑盒使用說明進(jìn)行IHC 染色（ROR-γ 抗體1∶100 稀釋），4℃孵育過夜。經(jīng)顯色、復(fù)染、分色、返藍(lán)、脫水等步驟后封片，直接鏡檢或室溫儲(chǔ)存。

1.2.4 IHC 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)與結(jié)果判讀 以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕褐色顆粒樣物質(zhì)，定義單個(gè)細(xì)胞的ROR-γ 陽性染色。以腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性細(xì)胞比例評(píng)分的乘積，定義組織的ROR-γ 染色總得分。腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：0 分為無著色；1 分為弱著色；2 分為中著色；3 分為強(qiáng)著色。陽性細(xì)胞比例評(píng)分：0分為0～1%；1 分為2%～10%；2 分為11%～50%；3分為51%～100%。將總得分≤4 分納入ROR-γ 低/無表達(dá)組；總得分>4 分納入ROR-γ 高表達(dá)組。

1.2.5 隨訪 通過查閱病歷、門診或電話隨訪獲取患者完整的隨訪資料。隨訪日期截至2020年9月，中位隨訪時(shí)間為88（7～115）個(gè)月，終點(diǎn)事件為無病生存期（disease-free survival，DFS）和OS。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。生存分析采用Log rank 檢驗(yàn)、Kaplan-Meier 生存曲線、多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 公共數(shù)據(jù)庫中ROR-γ mRNA 表達(dá)特點(diǎn)及預(yù)后意義

Oncomine 網(wǎng)站分析結(jié)果顯示，乳腺浸潤性癌組織中的ROR-γ mRNA 表達(dá)顯著高于癌旁組織（P<0.000 1，圖1）。Kaplan-Meier Plotter 網(wǎng)站生存分析結(jié)果表明（圖2），與低表達(dá)患者相比，ROR-γ mRNA 高表達(dá)患者的RFS 顯著延長（P<0.000 1），DMFS 和OS的組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；進(jìn)一步細(xì)分乳腺癌分子亞型，分析ROR-γ 表達(dá)在不同乳腺癌分子亞型中的潛在預(yù)后意義，發(fā)現(xiàn)在ER 陽性Luminal 型乳腺癌中，ROR-γ mRNA 的高表達(dá)與RFS 的延長相關(guān)（P=0.044），而不影響DMFS、OS（P>0.05）；對(duì)于PR陽性Luminal 型和HER-2 過表達(dá)型乳腺癌患者，ROR-γ mRNA 高、低表達(dá)患者間預(yù)后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而在TNBC 組織中，ROR-γ mRNA 高表達(dá)對(duì)患者的OS（P=0.520 0）無影響，卻與RFS 和DMFS 的縮短顯著相關(guān)（P<0.000 1）。相較于其他乳腺癌分子亞型，ROR-γ 在TNBC 中的潛在預(yù)后意義更為突出，與患者不良預(yù)后相關(guān)。

圖1 Oncomine 網(wǎng)站分析乳腺浸潤性癌與癌旁組織中的ROR-γ mRNA 表達(dá)

圖2 Kaplan-Meier Plotter 網(wǎng)站評(píng)估ROR-γ mRNA 在乳腺癌及乳腺癌不同分子亞型中的預(yù)后意義

2.2 TNBC 組織中的ROR-γ 蛋白表達(dá)

IHC 結(jié)果顯示，ROR-γ 蛋白表達(dá)定位于TNBC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核（圖3A），且ROR-γ 在TNBC組織中的表達(dá)高于癌旁組織（圖3B），患者的典型乳腺癌組織形態(tài)及ER、PR、HER-2 表達(dá)情況見圖4，5。

圖3 IHC 檢測(cè)TNBC 患者的ROR-γ 表達(dá)

圖4 TNBC 患者典型乳腺癌組織形態(tài)（HE×200）

2.3 TNBC 組織中的ROR-γ 蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

269 例TNBC 患者中，ROR-γ 蛋白高表達(dá)率為18.2%（49/269）。與ROR-γ 低/無表達(dá)組相比，ROR-γ高表達(dá)組患者具有較高的發(fā)病年齡（P=0.001）、已絕經(jīng)狀態(tài)(P<0.001)、高腫瘤Ki-67 指數(shù)（P=0.001）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.003），而乳腺癌家族史、p53 狀態(tài)、組織學(xué)類型、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小等其他臨床病理特征在ROR-γ 高、低/無表達(dá)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表1）。

2.4 TNBC 組織中的ROR-γ 蛋白表達(dá)與患者生存預(yù)后關(guān)系

與ROR-γ 低/無表達(dá)組相比，ROR-γ 高表達(dá)組患者的DFS（P=0.007）和OS（P=0.002）顯著縮短（圖6），預(yù)后不良。Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析的結(jié)果顯示，ROR-γ 蛋白表達(dá)、腫瘤T 分期和淋巴結(jié)狀態(tài)是TNBC 患者DFS（P=0.031，P=0.005 和P=0.002）和OS（P=0.029，P=0.014 和P=0.001）的獨(dú)立影響因素（表2）。與ROR-γ 低/無表達(dá)組相比，ROR-γ 高表達(dá)組患者腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加2.024 倍（HR=2.024），死亡風(fēng)險(xiǎn)增加2.403 倍（HR=2.403）。

圖5 IHC 檢測(cè)TNBC 患者 ER、PR、HER-2 表達(dá)（S-P×200）

表1 TNBC 組織中的ROR-γ 蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

圖6 ROR-γ 蛋白表達(dá)與TNBC 患者生存預(yù)后的關(guān)系

表2 影響TNBC 患者DFS 和OS 的Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析

3 討論

在惡性腫瘤中ROR-γ 表達(dá)呈現(xiàn)一定的組織差異，如在去勢(shì)治療抵抗的轉(zhuǎn)移性前列腺癌[6]、肝細(xì)胞肝癌[7]、胃癌[8]中ROR-γ 高表達(dá)，而在惡性黑色素瘤[9]、膀胱癌[10]中ROR-γ 表達(dá)則低于癌旁組織。在乳腺癌，ROR-γ 的表達(dá)特點(diǎn)及功能尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)ROR-γ 能促進(jìn)癌細(xì)胞的膽固醇合成誘發(fā)腫瘤的惡性進(jìn)展[11]，而另有研究指出ROR-γ 能通過負(fù)向調(diào)控腫瘤干細(xì)胞信號(hào)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化信號(hào)而發(fā)揮抑癌功能[12]，但鮮有研究進(jìn)行臨床樣本ROR-γ 蛋白水平的檢測(cè)與論證。

本研究通過對(duì)乳腺癌公共數(shù)據(jù)庫的分析，發(fā)現(xiàn)相較于其他分子亞型，TNBC 中ROR-γ mRNA 的表達(dá)呈現(xiàn)較顯著的潛在預(yù)后價(jià)值。269 例TNBC 患者組織樣本ROR-γ IHC 檢測(cè)的結(jié)果顯示，ROR-γ 蛋白在TNBC 組織中的表達(dá)高于癌旁組織，且與腫瘤的高Ki-67 指數(shù)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。提示ROR-γ 可能通過參與TNBC 細(xì)胞的增殖、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而發(fā)揮潛在的促癌作用，這與Oh 等[12]的研究結(jié)論不同，但因該研究納入的樣本量有限（13～15 例/組），檢驗(yàn)效能相對(duì)較低。同時(shí)研究對(duì)象遺傳背景的差異、HER-2 信號(hào)潛在干擾、ROR-γ 檢測(cè)抗體的不同也是導(dǎo)致差異結(jié)果的可能原因。

本研究中269 例患者的生存預(yù)后分析結(jié)果顯示，ROR-γ 蛋白高表達(dá)是TNBC 患者不良OS 和DFS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與ROR-γ mRNA 水平的分析結(jié)果相吻合，提示ROR-γ 可作為TNBC 患者腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物的潛在價(jià)值。雖有研究基于公共數(shù)據(jù)庫的分析得出與本研究不同的結(jié)論[12-13]，但ROR-γ作為一種核受體和轉(zhuǎn)錄因子，蛋白是其發(fā)揮分子功能的主要形式，相較于mRNA 水平的預(yù)測(cè)，蛋白水平的表達(dá)分析具有更可靠的參考價(jià)值。此外，在線生存分析時(shí)納入標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)判臨界值的設(shè)定也較大程度上影響了生存預(yù)測(cè)的結(jié)果。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與TNBC 不同，ER 陽性Luminal型乳腺癌中ROR-γ mRNA 的高表達(dá)與患者較好的RFS 相關(guān)。Cai 等的研究也指出，相較于ER 陽性Luminal 型乳腺癌，TNBC 腫瘤內(nèi)ROR-γ 激活相關(guān)的膽固醇合成與外流信號(hào)更為活躍，ROR-γ 對(duì)乳腺癌細(xì)胞膽固醇代謝的調(diào)控作用可能存在分子亞型特異性的特點(diǎn)[14]?；谀[瘤的異質(zhì)性，ROR-γ 作為核轉(zhuǎn)錄因子，或可通過直接或間接的作用參與不同分子亞型乳腺癌細(xì)胞內(nèi)差異的腫瘤信號(hào)，進(jìn)而影響患者的預(yù)后與生存。ROR-γ 在TNBC 中發(fā)揮促癌作用的分子機(jī)制，有待細(xì)胞、動(dòng)物水平研究的進(jìn)一步探索。ROR-γ 在乳腺癌其他分子亞型中的預(yù)后意義，有待大樣本、多分子亞型研究的補(bǔ)充論證。

綜上所述，ROR-γ 在TNBC 組織中高表達(dá)，且與腫瘤的增殖活躍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的不良預(yù)后相關(guān)，或可作為潛在的預(yù)后標(biāo)志物，為優(yōu)化TNBC 患者的治療帶來新的參考與思路。