王 飄， 鄭 晴， 胡 婷， 張海銀， 許言午， 包怡敏

(上海中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院， 上海 201203)

缺血性心臟病主要包括冠狀動脈疾病和急性心肌梗死等，是中老年人的常見病和多發(fā)病之一，其發(fā)病率也在逐年上升[1]。使缺血心肌及時恢復血流灌注及氧供應(yīng)是目前最常見的治療方法[2]，但在治療疾病的同時，缺血再灌注(ischemia/reperfution,I/R)可能導致氧自由基增加、鈣超載、細胞凋亡等，從而造成心肌細胞死亡，誘導心臟功能異常，即產(chǎn)生心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injurg,MIRI)[3]。由于MIRI的較高致死性和致殘性，因此減輕MIRI對于臨床治療缺血性心臟病具有重要意義。自噬可作為內(nèi)源性調(diào)節(jié)機制參與到I/R過程中[4，5]。有研究表明，當I/R損傷發(fā)生后心肌自噬水平也會增加[6]，但自噬在MIRI中的具體作用目前仍存在爭議。針對MIRI 損傷的治療，中藥因其毒副作用小、能從疾病多環(huán)節(jié)入手等優(yōu)勢而表現(xiàn)出較好的療效，如三七、人參等。三七的功效主要包括強心止血，現(xiàn)代藥理學表明三七的主要成分三七總皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)具有抗炎、抗氧化等藥理作用[7]?，F(xiàn)有研究表明，PNS對MIRI有一定的緩解作用，其主要作用途徑包括抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等[8，9]，但其能否通過自噬途徑減輕MIRI損傷的研究還較少。本研究通過觀察PNS對自噬的作用，探索PNS對抗I/R損傷保護心肌可能的作用機制。本研究方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準，批準號PZSHUTCM190609017。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠27只，約10周齡，上海市斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2012-0002。統(tǒng)一飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境相對濕度(55±10)%，溫度(23±2)℃，自由飲水并給予普通飲食，光照周期12 h/12 h明暗交替。

1.2 藥品、試劑與儀器

血栓通注射液組成成分為三七總皂苷(昆明制藥集團股份有限公司，批號13HK03)；血清肌鈣蛋白T(cTnT)ELISA檢測試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號CSB-E11403r，批號X03033170)；抗體包括SQSTM1/p62(CST，貨號5114 s)、Beclin-1(CST，貨號3495 s)、LC3B/MAP1LC3B(Novus，貨號NB100-2220)。酶標儀(美國伯騰儀器有限公司，型號Synergy)；動物呼吸機(成都儀器廠，型號DHX-300)；多通道生物信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠，型號RM6240BD)。

1.3 分組與造模

將大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(I/R)和三七總皂苷組(I/R+PNS)各9只。采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支(LAD)法建立大鼠心肌I/R模型，麻醉后仰臥位固定并行氣管插管，連接呼吸機維持呼吸(90次/min，呼吸比為1∶2，潮氣量8～10 mL)，在左胸骨第四肋處行胸廓切開術(shù)以暴露心臟，并用5-0縫合線結(jié)扎LAD。缺血40 min后松開縫合線恢復血流灌注2 h。Sham組大鼠心肌不進行LAD結(jié)扎，其余手術(shù)步驟均相同。I/R + PNS組大鼠于造模前30 min腹腔注射PNS(50 mg/kg)[10]，其他大鼠腹腔注射生理鹽水(10 ml/kg)。

1.4 大鼠心功能檢測

右頸總動脈插管至左心室，另一端連接生物信號采集處理系統(tǒng)，在造模過程中記錄左心室內(nèi)壓力(LVP)曲線，測量左心室等容收縮期壓力最大變化速率(+dp/dtmax)、左心室等容舒張期壓力最大變化速率(-dp/dtmax)、左心室平均收縮壓(mLVSP)、左心室平均舒張壓(mLVDP)、左心室開始收縮至達到室內(nèi)壓最大上升速率時間(t-dp/dtmax)的變化，并計算左心室發(fā)展壓(DP，DP=mLVSP-mLVDP)。

1.5 心肌組織形態(tài)學觀察

再灌注結(jié)束后立即取下心臟，于預(yù)冷的生理鹽水中沖洗后切取左心室前壁心肌。經(jīng)預(yù)冷的4%多聚甲醛固定后流水沖洗12 h，隨后將標本進行脫水處理，脫水標本浸泡于二甲苯中，常規(guī)石蠟包埋切片后進行HE染色。染色結(jié)束后用常規(guī)樹脂進行封片，并于光學顯微鏡下觀察心肌病理學改變。

1.6 血清心肌損傷標志物檢測

再灌注結(jié)束后取頸總動脈血，室溫靜置30 min，3000 r/min離心10 min回收血清。根據(jù)說明將標準品和樣品加入微孔板中37 ℃下孵育2 h，隨后依次加入生物素抗體、HRP稀釋液和底物溶液，并根據(jù)要求孵育不同時長，最后添加終止液終止反應(yīng)，酶標儀450 nm波長讀取光密度(OD)值，計算血清中cTnT含量。

1.7 Western blot檢測

剪取缺血再灌注區(qū)域心肌組織適量，勻漿后以4 ℃ 14000 r/min離心20 min，取上清獲得組織總蛋白。采用BCA法檢測蛋白濃度，蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA封閉1 h后加入稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，之后使用適宜的二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶，Image J軟件測定條帶灰度值，目的蛋白相對表達量用目的蛋白與內(nèi)參(GAPDH)比值表示。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 三七總皂苷對大鼠心功能的影響

血流動力學能夠靈敏地反映心臟收縮和舒張功能。與Sham組比較，大鼠心肌缺血40 min，再灌注2 h后左心室的+dp/dtmax呈下降趨勢，DP明顯減小，t-dp/dtmax顯著增大(P<0.05)，說明心室收縮功能下降(圖1A、1C、1 D)，-dp/dtmax顯著下降表明心肌舒張功能也降低(圖1B)(P<0.05)。PNS預(yù)處理可以明顯減輕上述指標的變化，改善心功能。

注：與Sham組比較：*P<0.05；與I/R組比較：#P<0.05，n=9

2.2 三七總皂苷對大鼠心肌組織形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠的心肌組織纖維分布整齊、形態(tài)完整，無纖維結(jié)構(gòu)改變；模型組出現(xiàn)大鼠心肌組織肌纖維紊亂甚至斷裂、肌絲溶解等病理變化；而在PNS組中，由于缺血再灌注所引起心肌組織形態(tài)的損傷情況有明顯改善(圖2)。

圖2 各組大鼠心肌組織形態(tài)HE染色結(jié)果比較(×200)

2.3 三七總皂苷對大鼠血清肌鈣蛋白含量的影響

血清中的肌鈣蛋白含量可以反映心肌細胞受損情況。與Sham組比較，I/R組血清cTnT含量明顯升高(P<0.05)，提示心肌細胞損傷嚴重；而與I/R組比較，PNS組血清cTnT明顯含量下降(圖3)(P<0.05)，表明PNS可以有效改善因I/R所引起的心肌細胞損傷情況。

注：與Sham組比較：*P<0.05；與I/R組比較：#P<0.05，n=3

2.4 三七總皂苷對大鼠心肌細胞自噬相關(guān)蛋白的影響

與Sham組比較，I/R組心肌組織Beclin-1、LC3Ⅱ的蛋白表達明顯升高(P<0.05)，P62蛋白表達有上升趨勢但差異無統(tǒng)計學意義；與I/R組比較，PNS組大鼠心肌組織蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ的表達明顯降低(圖4C，4 D)，P62蛋白表達明顯升高(圖4B)(P<0.05)，表明PNS對自噬有明顯的抑制作用。

注：與Sham組比較：*P<0.05；與I/R組比較：#P<0.05，n=5～6

3 討論

缺血性心臟病目前是全球死亡率最高的疾病，臨床主要的治療手段包括溶栓治療或經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)等，以期達到恢復血流灌注的目的[11]。然而心肌組織發(fā)生缺血后，恢復血流灌注時可能會發(fā)生組織損傷進行性加重的過程，即缺血再灌注損傷(MIRI)[3]。

MIRI具體表現(xiàn)主要包括心功能下降、心肌組織結(jié)構(gòu)破壞、心肌內(nèi)肌鈣蛋白釋放等。心功能下降主要包括心肌收縮和舒張能力減弱，一般可用血流動力學指標反映心功能的變化[12]。+dp/dtmax和-dp/dtmax為衡量心臟收縮和舒張功能的經(jīng)典指標，當心肌收縮功能或舒張功能障礙時其值降低[13]。本實驗結(jié)果同樣顯示，當發(fā)生I/R時，+dp/dtmax和-dp/dtmax值明顯降低；而經(jīng)過PNS預(yù)處理后+dp/dtmax和-dp/dtmax下降趨勢有明顯改善，說明PNS可以改善因缺血所導致的心臟收縮及舒張功能障礙。除+dp/dtmax外，左心室發(fā)展壓(DP)和t-dp/dtmax也可以反映心室收縮功能，當心肌收縮功能障礙時DP值降低，t-dp/dtmax值升高。本研究結(jié)果也顯示，I/R過程中DP呈明顯下降趨勢，t-dp/dtmax值明顯升高；而用PNS預(yù)處理后DP值有明顯的上升，t-dp/dtmax值有明顯的下降，同樣說明PNS預(yù)處理后心室收縮功能障礙得到改善。因此，進行PNS預(yù)處理可以有效減輕因I/R所導致的心肌收縮和舒張功能障礙，從而達到保護心功能的目的。

除血流動力學指標外，心肌組織病理學觀察及血清中肌鈣蛋白含量檢測也可以判斷心肌損傷情況。當出現(xiàn)心肌損傷時，會發(fā)生心肌纖維排列紊亂、肌纖維斷裂、溶解、壞死等現(xiàn)象[14]。本研究中，HE光鏡染色結(jié)果顯示，I/R組有明顯的心肌纖維排列紊亂、橫紋消失、心肌萎縮、肌纖維斷裂溶解、心肌間質(zhì)水腫等現(xiàn)象，說明此時心肌損傷明顯；PNS預(yù)處理的大鼠心肌肌纖維排列較整齊，與I/R組比較病理變化不明顯，說明PNS能有效改善I/R所引起的心肌損傷。心肌肌鈣蛋白T(cTnT)主要存在于心肌組織中，對心肌損傷具有高度的特異性和敏感性。當心肌細胞受損時，由于細胞結(jié)構(gòu)和膜通透性被破壞，cTnT發(fā)生降解并釋放到血清中，其血清中含量越多表明心肌損傷越嚴重[15]。本研究中，ELISA結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組血清cTnT含量明顯升高，提示再灌注后心肌損傷較嚴重；PNS預(yù)處理明顯降低血清中cTnT的含量，說明PNS可以有效改善心肌損傷的情況。

自噬是將功能失調(diào)或受損的細胞質(zhì)成分靶向溶酶體進行降解和再循環(huán)，從而維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一個過程[16]。當心肌缺血再灌注發(fā)生后，受損的心肌中自噬水平會發(fā)生改變。目前研究表明，抑制過度自噬可以起到保護心肌抗缺血再灌注損傷的作用[17]，也有部分研究認為促進自噬發(fā)生也可以起到相同作用[18]。而本實驗研究結(jié)果顯示，通過抑制過度自噬可以起到抗心肌缺血再灌注損傷的作用。正常生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)自噬處于基礎(chǔ)水平；而當I/R發(fā)生后，為應(yīng)對氧化應(yīng)激等反應(yīng)，使得自噬不斷增強，過度自噬則導致心肌細胞大量死亡，從而引起MIRI[19]。Beclin-1是細胞自噬起始階段的關(guān)鍵因子，可反映細胞自噬水平的高低[20]，自噬被抑制時Beclin-1表達被抑制。LC3是存在于自噬體的蛋白且對自噬體的形成起到重要作用，LC3主要以非脂質(zhì)形式存在于細胞中，即LC3Ⅰ；當自噬發(fā)生時，LC3Ⅰ 脂化形成LC3Ⅱ[21，22]。因此，LC3Ⅱ也被用作反映自噬水平的標記物，當自噬增強時，LC3Ⅱ 表達也隨之上調(diào)。本研究中，I/R組的Beclin-1、LC3Ⅱ 蛋白表達明顯升高，說明此時自噬水平明顯上升；而PNS預(yù)處理有效改善了這種升高趨勢，使得Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達含量明顯降低，表明PNS對自噬有一定的抑制作用。為進一步說明PNS對自噬的下游環(huán)節(jié)是否具有調(diào)節(jié)作用，本實驗又對自噬相關(guān)蛋白P62進行了檢測。P62是自噬受體同時也是自噬選擇性底物[23]，可以直接與LC3結(jié)合形成自噬體[24]，最終被運送至溶酶體系統(tǒng)形成自噬溶酶體并降解；而當自噬體與溶酶體結(jié)合受阻時，則會導致P62與泛素化產(chǎn)物結(jié)合，導致其表達水平升高。有研究表明，當自噬被抑制時，P62蛋白表達水平升高[25]。本研究結(jié)果同樣顯示，I/R過程中P62表達沒有明顯的升高趨勢，說明此時自噬體與溶酶體結(jié)合正常，自噬處于正常發(fā)生狀態(tài)；而PNS預(yù)處理則使得P62表達明顯升高，說明自噬體與溶酶體結(jié)合受阻，自噬處于被抑制狀態(tài)。綜合以上結(jié)果可以看出，PNS可以上調(diào)心肌組織中P62蛋白的表達，同時下調(diào)Beclin-1、LC3Ⅱ的蛋白表達量，說明PNS可以通過抑制自噬起始環(huán)節(jié)及下游自噬體與溶酶體的結(jié)合，達到抑制自噬過度發(fā)生的目的，從而保護心肌抗缺血再灌注損傷。

綜上所述，PNS可以有效改善心肌缺血再灌注損傷大鼠的心功能，減輕心肌組織病理損傷，其作用機制可能與抑制過度自噬有關(guān)，最終達到保護心臟抗心肌缺血再灌注損傷的目的。