吳微華，俞振飛，程抗，安鵬，張偉，陳雲(yún)，葉肖琳

（1.杭州市丁橋醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 杭州310021；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 杭州310005）

膿毒癥休克是重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）患者死亡的主要原因，具有發(fā)病急、進(jìn)展快、病死率高等特點(diǎn)，由于膿毒癥休克臨床表現(xiàn)錯(cuò)綜復(fù)雜，因此準(zhǔn)確評(píng)估膿毒癥休克患者的病變嚴(yán)重程度及預(yù)后，對(duì)降低病死率具有重要意義[1]。人源性激肽釋放酶結(jié)合蛋白（Kallistatin, Kal）是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，在人類(lèi)組織和體液中廣泛分布，具有抗炎、抗腫瘤、抗血管生成、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等作用，參與炎癥、高血壓、心肌梗死、腫瘤、纖維化、血管生成等多種疾病的病理生理學(xué)過(guò)程，有研究顯示Kal 在肺炎[2]、血管炎[3]、骨關(guān)節(jié)炎[4]等多種疾病中發(fā)揮抗炎作用，然而，血清Kal 作為評(píng)估膿毒癥休克患者預(yù)后的生物標(biāo)志物的臨床價(jià)值仍有待闡明。膿毒癥休克的核心病理過(guò)程是炎癥和氧化應(yīng)激導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷、毛細(xì)血管滲漏，血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin, VE-cad）是血管內(nèi)皮細(xì)胞之間黏附連接的特異性鈣黏蛋白，在維持血管內(nèi)皮細(xì)胞極性和完整性等方面具有重要作用[5]，但血清VE-cad 的表達(dá)與膿毒癥休克患者疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的研究尚不多見(jiàn)。本研究通過(guò)檢測(cè)不同預(yù)后膿毒癥休克患者血清Kal、VE-cad 水平變化，分析Kal、VE-cad 與急性生理學(xué)及慢性健康狀況Ⅱ（APACHE Ⅱ）評(píng)分和序貫器官功能衰竭估計(jì)（SOFA）評(píng)分的相關(guān)性，旨在探討兩者對(duì)膿毒癥休克患者預(yù)后評(píng)估的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2016年3月—2018年3月杭州市丁橋醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的膿毒癥休克患者252例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料完整；②符合“膿毒癥3.0 指南”的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；③年齡≥18 歲；④住院時(shí)間＞1 d；⑤患者或家屬知情同意并簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠；②中樞神經(jīng)系統(tǒng)或嚴(yán)重免疫缺陷；③心力衰竭；④慢性肝腎疾病終末期、腫瘤晚期；⑤既往存在煙草、酒精或毒品依賴(lài)；⑥臨床資料不完整；⑦依從性差。最終納入研究的患者為178例。本研究經(jīng)杭州市中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。根據(jù)患者28 d預(yù)后，分為存活組120例和死亡組58例。兩組年齡、性別、感染類(lèi)型、病原學(xué)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑

Sysmex XT-4000i 全自動(dòng)五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀購(gòu)自日本希森美康株式會(huì)社，BS-600 全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自中國(guó)深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，OTTOMAN 全自動(dòng)特定蛋白即時(shí)檢測(cè)分析儀購(gòu)自中國(guó)武漢錦之琪醫(yī)療器械有限公司，VITROS5600 全自動(dòng)生化免疫分析儀購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生公司。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D systems 公司，“三明治免疫夾心法”檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。

1.3 方法

采集患者入院24 h 內(nèi)外周靜脈血5 ml，2 管分裝，其中一管注入EDTA 抗凝試管，不經(jīng)離心處理，置于-20℃冰箱保存，采用Sysmex XT-4000i 全自動(dòng)五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)白細(xì)胞（WBC）水平，另一管經(jīng)3 000 r/min 離心5 min，取上清液，置于-20℃冰箱保存，采用BS-600 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清白蛋白（ALB）水平；采集患者入ICU 第1 天、第3 天、第5 天的外周靜脈血5 ml，3 000 r/min 離心5 min，取上清液，置于-20℃冰箱保存，采用OTTOMAN 全自動(dòng)特定蛋白即時(shí)檢測(cè)分析儀檢測(cè)血清C 反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）水平；采用ELISA 法檢測(cè)血清Kal 水平，采用“三明治免疫夾心法”檢測(cè)血清VE-cad 水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 膿毒癥休克患者治療措施及觀察指標(biāo)

積極液體復(fù)蘇、抗感染、肺保護(hù)性機(jī)械通氣、血管活性藥物和控制血糖等，血管活性藥物多巴胺初始劑量為1 μg/（kg·min）、逐漸增加劑量≤20 μg/（kg·min），去甲腎上腺素初始劑量為0.05 μg/（kg·min）、逐漸增加劑量≤0.5 μg/（kg·min）[7]。收集患者的姓名、年齡、性別、機(jī)械通氣時(shí)間、感染類(lèi)型、ICU住院時(shí)間。入院24 h內(nèi)行PICCO監(jiān)測(cè)，當(dāng)日指標(biāo)為每天3次測(cè)量的平均值，并記錄血管外肺水指數(shù)（EVLWI）及其他血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，連續(xù)監(jiān)測(cè)5 d 或患者死亡?；颊呷朐?4 h內(nèi)采集外周靜脈血進(jìn)行血培養(yǎng)并檢測(cè)病原學(xué)情況，同時(shí)對(duì)患者進(jìn)行APACHEⅡ評(píng)分[8]及SOFA 評(píng)分[9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，比較做t檢驗(yàn)或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析用Pearson 法，繪制ROC 曲線，采用Logistic 回歸分析膿毒癥休克死亡的危險(xiǎn)因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床指標(biāo)的比較

兩組性別、年齡、感染部位、病原學(xué)、WBC比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組CRP、PCT、氧合指數(shù)、EVLWI、ALB、機(jī)械通氣時(shí)間、ICU 住院時(shí)間、APACHEⅡ評(píng)分及SOFA 評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），死亡組的氧合指數(shù)和ALB 低于存活組，機(jī)械通氣時(shí)間、ICU 住院時(shí)間長(zhǎng)于存活組，CRP、PCT、EVLWI、APACHEⅡ評(píng)分和SOFA 評(píng)分高于存活組。見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床指標(biāo)的比較

2.2 兩組血清Kal、VE-cad水平比較

兩組入住ICU 第1 天、第3 天、第5 天血清Kal、VE-cad 水平比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：不同時(shí)間點(diǎn)的血清Kal、VE-cad 水平有差異（F=185.920 和308.918，均P=0.000）；兩組血清Kal、VE-cad 水平有差異（F=456.521 和535.773，均P=0.000），死亡組血清Kal 水平均低于存活組，死亡組血清VE-cad 水平均高于存活組；兩組血清Kal、VE-cad 水平變化趨勢(shì)有差異（F=24.068 和3.965，P=0.000 和0.047）。見(jiàn)表2 和圖1。

表2 兩組血清Kal、VE-cad水平的比較 （x±s）

圖1 存活組和死亡組血清Kal、VE-cad水平的不同時(shí)間點(diǎn)變化趨勢(shì)

2.3 血清Kal、VE-cad與APACHEⅡ評(píng)分和SOFA評(píng)分的相關(guān)性

血清Kal 與APACHE Ⅱ評(píng)分和SOFA 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；血清VE-cad 與APACHEⅡ評(píng)分和SOFA 評(píng)分呈正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 血清Kal、VE-cad與APACHEⅡ評(píng)分和SOFA評(píng)分的相關(guān)性

2.4 入院24 h 內(nèi)血清Kal、VE-cad 單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)膿毒癥休克患者死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值

入院24 h 內(nèi)血清Kal、VE-cad 單獨(dú)與兩者聯(lián)合檢測(cè)的曲線下面積（AUC）分別為0.687（95%CI：0.604，0.770）、0.859（95%CI：0.805，0.912）、0.890（95%CI：0.845，0.936）。血清Kal 檢測(cè)預(yù)測(cè)膿毒癥休克患者死亡的敏感性為81.0%（95%CI：0.772，0.854），特異性為50.0%（95%CI：0.474，0.531）；VE-cad 檢測(cè)預(yù)測(cè)膿毒癥休克患者死亡的敏感性為69.0%（95%CI：0.649，0.726），特異性為86.7%（95%CI：0.822，0.914）；血清Kal 和VE-cad 聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)膿毒癥休克患者死亡的敏感性為82.2%（95%CI：0.781，0.868），特異性為89.6%（95%CI：0.852，0.954）。見(jiàn)表4 和圖2。

表4 Kal、VE-cad單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)膿毒癥休克患者死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖2 Kal、VE-cad單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)判斷膿毒癥休克預(yù)后的ROC曲線

2.5 膿毒癥休克患者死亡的影響因素

以膿毒癥休克患者28 d 預(yù)后狀況為因變量（1=死亡，0=存活），以表1、2 中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素為自變量，建立非條件Logistic 回歸模型。初選11 個(gè)指標(biāo)作為自變量，考慮到陽(yáng)性樣本量較少，將由患者病情嚴(yán)重程度引起的4 個(gè)關(guān)聯(lián)指標(biāo)（機(jī)械通氣時(shí)間、ICU 住院時(shí)間、APACHE Ⅱ評(píng)分及SOFA 評(píng)分）剔除，實(shí)際納入7 個(gè)自變量?；貧w過(guò)程采用逐步后退法，α入=0.05，α出=0.10。結(jié)果：CRP[=1.221（95% CI：1.022，1.459）]、PCT[ O^ R=1.195（95% CI：1.035，1.380）]、VE-cad[=1.373（95% CI：1.055，1.787）]、EVLWI[=1.846（95% CI：1.178，2.893）]是膿毒癥休克患者死亡的危險(xiǎn)因素，Kal[=0.428（95CI%：0.190，0.966）]是膿毒癥休克患者死亡的保護(hù)因素。見(jiàn)表5。

表5 膿毒癥休克死亡的二元Logistic回歸分析參數(shù)

3 討論

膿毒癥是一種危及生命器官功能障礙綜合征，是因宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而引起，膿毒癥休克是一種更為嚴(yán)重的危及生命的膿毒癥類(lèi)型，盡管對(duì)膿毒癥休克的發(fā)病機(jī)制和治療的認(rèn)識(shí)不斷進(jìn)步，但其死亡率仍然很高[10-11]。內(nèi)皮細(xì)胞活化是一種對(duì)感染的正常適應(yīng)性反應(yīng)，內(nèi)皮功能障礙是膿毒癥和膿毒癥休克的重要病理生理過(guò)程之一，其特征是血管通透性增加、血管舒縮張力改變、細(xì)胞黏附、凝血和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡得到促進(jìn)，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)導(dǎo)致血管張力明顯降低，微血管彌散性改變、通透性增加和彌散性血管內(nèi)凝血[12]。現(xiàn)有臨床研究顯示，許多生物標(biāo)志物與內(nèi)皮功能障礙有關(guān)[13]，并且用于評(píng)估血管內(nèi)皮活性的血清生物標(biāo)志物與膿毒癥疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)[14]。

Kal 是一種激肽釋放酶結(jié)合蛋白，目前已知其具有多種功能，包括抗炎、抗腫瘤、抗血管生成、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等作用[15]。研究顯示Kal 作為膿毒癥、社區(qū)獲得性肺炎、急性胰腺炎、血管和器官損傷、主動(dòng)脈瘤等疾病的新型血清分子標(biāo)志物具有廣闊前景[16-17]。Kal 對(duì)膿毒癥休克患者器官保護(hù)的可能機(jī)制如下：誘導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的合成，抑制促炎因子如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、Toll樣受體4（TLR4）、血管黏附因子-1 和細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1 的表達(dá)，抑制核因子-κB（NF-κB）激活，抑制Caspase-3 活性和凋亡[18]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bEGF）是血管新生的重要分子，Kal 可與VEGF、bEGF 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合其內(nèi)皮細(xì)胞表面的乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）受體從而阻斷血管生成信號(hào)通路[19]。LIN 等[20]研究顯示血清Kal 水平在膿毒癥休克合并社區(qū)獲得性肺炎患者表達(dá)較低。LI 等[17]體內(nèi)研究顯示，外源性Kal明顯減輕膿毒癥造模大鼠的炎癥反應(yīng)、器官損傷，并且可有效降低模型大鼠的病死率。王宏斌等[21]研究顯示膿毒癥休克患者死亡組血清Kal 水平低于存活組，Kal 水平與膿毒癥休克、APACHEⅡ評(píng)分、SOFA 評(píng)分及CRP 水平呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，死亡組血清Kal 水平低于存活組，且膿毒癥休克患者血清Kal 水平與APACHEⅡ評(píng)分和SOFA 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)；ROC 曲線分析顯示，當(dāng)血清Kal 水平到達(dá)臨界值3.862 μg/ml 時(shí)，其預(yù)測(cè)膿毒癥休克患者死亡的敏感性為81.0%，特異性為50.0%，表明血清Kal 預(yù)測(cè)膿毒癥休克患者死亡的敏感性較高，但特異性較差。本研究進(jìn)一步采用Logistic 回歸分析結(jié)果顯示Kal 水平高是影響膿毒癥休克患者死亡的保護(hù)因素。王宏斌等[21]研究顯示Kal 水平低是膿毒癥休克和嚴(yán)重膿毒癥患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。LIN 等[20]研究顯示，膿毒癥休克合并社區(qū)獲得性肺炎患者第1 天Kal 水平越高，死亡的風(fēng)險(xiǎn)越低，因此他們認(rèn)為Kal 水平可以作為膿毒癥休克合并社區(qū)獲得性肺炎患者病情嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)標(biāo)志物，這可能與Kal 本身具有抗炎和抗凝作用有關(guān)，當(dāng)然Kal 能否作為診斷標(biāo)志物仍需大量臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。

VE-cad 在維持血管內(nèi)皮屏障完整性方面發(fā)揮著重要作用，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，其水平不斷升高[22-23]。本研究顯示，死亡組血清VE-cad 水平較存活組高，并且持續(xù)保持較高水平，而存活組血清VE-cad 水平逐漸降至正常水平，表明血管內(nèi)皮屏障遭到破壞，并且膿毒癥休克組血清VE-cad 水平與APACHEⅡ評(píng)分和SOFA 評(píng)分呈正相關(guān)，ROC 曲線分析顯示，當(dāng)血清VE-cad 水平到達(dá)臨界值3.350 ng/ml時(shí)，其預(yù)測(cè)膿毒癥休克患者死亡的敏感性為69.0%，特異性為86.7%，表明血清VE-cad 預(yù)測(cè)膿毒癥休克患者死亡的特異性較高，但敏感性較差。但兩者聯(lián)合檢測(cè)時(shí)其敏感性和特異性分別為82.2%和89.6%，說(shuō)明聯(lián)合檢測(cè)對(duì)評(píng)估膿毒癥休克患者的預(yù)后具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，因此兩者的聯(lián)合檢測(cè)可能作為臨床評(píng)估膿毒癥休克患者預(yù)后的重要手段。

本研究亦發(fā)現(xiàn)，死亡組ALB 水平、氧合指數(shù)均低于存活組，而機(jī)械通氣時(shí)間、ICU 住院天數(shù)長(zhǎng)于存活組，EVLWI 水平高于存活組，并且VE-cad、EVLWI 是影響膿毒癥休克患者死亡的危險(xiǎn)因素。其可能機(jī)制如下：在炎癥和氧化應(yīng)激刺激下，VE-cad與連環(huán)蛋白連接遭到破壞，血管內(nèi)皮屏障遭到破壞，血液中的白蛋白滲漏到組織間隙，導(dǎo)致ALB 水平下降，而ALB 水平降低可致肺水腫，進(jìn)而影響肺換氣彌散功能，導(dǎo)致氧合指數(shù)降低，EVLWI 升高，死亡組血清VE-cad 升高，表明嚴(yán)重的血管屏障受損使液體正平衡被促發(fā)，而液體正平衡是影響該疾病患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[24-25]。液體正平衡可使心臟前負(fù)荷增加，影響VE-cad 與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接，使細(xì)胞連接張力下降，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞間形成出現(xiàn)縫隙[26]。由于VE-cad 在維持內(nèi)皮屏障完整性中的重要意義，目前已有研究認(rèn)為VE-cad可能作為血管內(nèi)皮屏障修復(fù)的靶標(biāo)[27]。

綜上所述，CRP、PCT、Kal、VE-cad、EVLWI均是膿毒癥休克患者死亡的影響因素，研究膿毒癥休克患者血清中Kal、VE-Cad 水平變化有助于評(píng)估疾病預(yù)后，并且兩者作為新型血清分子標(biāo)志物具有廣闊的應(yīng)用前景。