閆嵩 任偉超 徐姣 劉美琦 于欣欣 王思嘉 馬偉

摘要：通過對柳屬植物種質(zhì)資源品質(zhì)特征的探究，對其進(jìn)行初步的鑒定與評價。柳屬種質(zhì)資源評價模型基于生長和藥用性狀進(jìn)行構(gòu)建。其中杞柳、筐柳、谷柳的總黃酮含量較高，杞柳含量達(dá)0.225 6 mg/g;筐柳、金絲垂柳、松江柳的原花青素含量較高，筐柳含量達(dá)0.156 8 mg/g;五蕊柳、筐柳、細(xì)葉沼柳的木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量較高，五蕊柳含量達(dá)2.130 7 mg/g。以構(gòu)建的科學(xué)評價方法，篩選出6種具有良好利用價值的優(yōu)良種質(zhì)資源，分別為旱垂柳、五蕊柳、金絲垂柳、筐柳、旱柳和垂柳。為實(shí)現(xiàn)各指標(biāo)的量化性和直觀性，本研究構(gòu)建了科學(xué)的評價方法，為柳屬育種篩選、傳統(tǒng)育種及分子育種研究提供種質(zhì)資源，為柳屬植物藥用成分開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：柳屬;生長性狀;藥用性狀;種質(zhì)資源;綜合評價

中圖分類號： S792.120.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）17-0128-06

收稿日期：2021-01-05

基金項(xiàng)目：國家中醫(yī)藥管理局全國中藥資源普查項(xiàng)目（編號：GZY-KJS-2018-004）;黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀創(chuàng)新人才領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（編號：2018RCL09）。

作者簡介：閆 嵩（1989—），男，黑龍江哈爾濱人，博士，主要從事中藥資源研究。E-mail：394576931@qq.com。

通信作者：馬 偉，博士，研究員，主要研究方向?yàn)樗幱弥参锷锕こ?。E-mail：mawei@hljucm.net。

柳屬（Salix）是楊柳科（Salicaceae）中最大的一個屬。柳屬種類繁多，有520多種，主產(chǎn)于北半球溫帶地區(qū)，少量分布在南美洲和非洲的南部[1-3]。柳屬植物的樹皮中含有單寧，可供工業(yè)應(yīng)用或藥用，嫩枝葉可作動物飼料，同時也是早春蜜源植物[4]。在生態(tài)方面，柳屬植物因具有發(fā)達(dá)的根系可有效保持水土、防風(fēng)固沙。柳屬植物由于含有多種藥效活性化學(xué)成分而具有廣泛的藥理作用[5-11]。柳屬的葉、皮、花序等部位的提取物在抗血栓、降血壓、抗應(yīng)激、促進(jìn)免疫力、抗炎、止痛、利尿、凝血、抗腫瘤等方面具有良好的臨床效果[12]。

目前，關(guān)于柳屬植物的資源評價主要圍繞光能利用效率評價[13]、抗鹽堿性評價[14]、觀賞性評價以及用材價值評價[15]等，缺少關(guān)于柳屬植物的藥用價值的評價，忽略了柳屬的部分經(jīng)濟(jì)價值，未能合理全面地利用柳屬植物價值。因此，對資源豐富、原料易得的柳屬植物建立以藥用成分為評價指標(biāo)的評價體系，將有助于柳屬植物種質(zhì)資源評價及利用，篩選出具有活性強(qiáng)、療效高、毒副作用小的天然藥用成分，對柳屬的藥用植物開發(fā)與利用具有重要意義。本研究以采自黑龍江省的26種柳屬種質(zhì)資源為材料，采用層次分析法，基于生長性狀和藥用性狀對柳屬綜合性狀進(jìn)行分析與測定，并建立不同權(quán)重的決策指數(shù)綜合評價法。

1 儀器與材料

HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海邦西儀器科技有限責(zé)任公司），BMB 224型電子分析天平（蘇州坤宏電子有限公司），UV-1601 PC型紫外-可見分光光度計(jì)（SHIMADZU日本島津），Waters 2695-2996型高效液相色譜儀（美國Waters公司），Waters 2998型紫外檢測儀器（美國Waters公司）。

蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品、原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院），木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（四川維克奇生物科技有限公司），亞硝酸鈉，氫氧化鈉，硝酸鋁，無水乙醇，冰醋酸，濃鹽酸，香草醛、石油醚（60～90 ℃）均為分析純，甲醇（分析純、色譜純）（哈爾濱沃森實(shí)驗(yàn)用品經(jīng)銷部）。

試驗(yàn)用柳屬植物葉片采自黑龍江省森林植物園、小興安嶺植物園、大興安嶺塔河地區(qū)，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，具體柳屬原料來源見表1。

2 試驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液制備

取供試品粉碎，過40目篩，精密稱取2.00 g。

稱量100 mL石油醚（60～90 ℃）倒入索式提取器，恒溫水浴鍋90 ℃加熱，回流提取1.5 h;棄去石油醚，燒瓶中加入100 mL甲醇/50%乙醇，再加熱 60 ℃，回流提取4 h，過濾，將甲醇濾液抽濾，定容至50 mL，取2 mL溶液，再用10 mL容量瓶定容。經(jīng)有機(jī)系微孔濾膜（直徑為0.45 μm）過濾后，將樣品置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 對照品溶液的配制

稱取蕓香苷對照品109.80 mg，加50%乙醇溶解后，置于100 mL容量瓶中定容，制成濃度為1.098 0 mg/mL的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液;稱取原花青素對照品20.54 mg，加50%乙醇溶解后，用50 mL容量瓶定容，配制成濃度為0.410 8 mg/mL的對照品溶液;稱取木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品20.00 mg，加入甲醇，用100 mL容量瓶定容，取 4 mL 至20 mL容量瓶稀釋至刻度，搖勻制得對照品溶液。以上溶液均用錫紙包裹后，在4 ℃冰箱中遮光保存。

2.3 紫外-可見分光光度法

取蕓香苷對照品溶液2.5 mL和待測樣品溶液1 mL，分別置于25 mL具塞試管中補(bǔ)充溶液至 10 mL，分別加入顯色劑，定容至25 mL靜置 20 min。將對照品溶液和待測樣品溶液在430～700 nm 波長內(nèi)進(jìn)行掃描，選取兩者最大吸收值對應(yīng)的波長作為蕓香苷的最大吸收波長。

取原花青素對照品溶液和待測樣品溶液各 1 mL，分別置于10 mL具塞試管中，分別依次加入顯色劑，搖勻后用甲醇定容至10 mL，室溫條件下遮光反應(yīng)20 min。以甲醇作為空白參比，設(shè)置波長 400～700 nm，將對照品溶液和待測樣品溶液進(jìn)行掃描，選取兩者共同最大吸收值的波長為原花青素的最大吸收波長。

2.4 高效液相色譜法

本研究利用高效液相色譜法測定柳屬中木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷成分的含量，確定色譜條件[16]：色譜柱Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）、醋酸水（醋酸與水的體積比為1 ∶100）（B），體積流量1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，檢測波長為254 nm。線性洗脫程序：15% A （0～20 min）;100% A （20.01～40 min）。流動相比例的選擇：流動相15%～30% A（0～5 min），30%～50% A（5～8 min），50%～52% A（8～16 min），52%～54%A（16～20 min）。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取待測樣品1.0 mL于試管中，每2 h測定待測品溶液總黃酮和原花青素的吸光度（D），連續(xù)測定12 h，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果通過統(tǒng)計(jì)可知，二者相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.82%、1.08%。證明樣品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。高效液相色譜儀測定待測樣品，分別放置5、10、24、35、48 h進(jìn)樣，測量木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷吸收峰面積，RSD為0.85%，說明提取物中木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的穩(wěn)定性良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

2.6.1 考察紫外-可見分光光度計(jì)的精密度 連續(xù)6次測定樣品的吸光度，發(fā)現(xiàn)6次測量結(jié)果RSD為0.68%，證明該儀器的精密度良好。

2.6.2 考察高效液相色譜的精密度 連續(xù)6次測定樣品的峰面積，發(fā)現(xiàn)6次測量結(jié)果RSD為1.46%，說明該儀器的精密度良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取同一待測樣品1.0 mL共3份，每份加入蕓香苷、原花青素、木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品1.098、0.410 8、1.0 mL，然后進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，3份樣品的回收率分別為96%～104%、97%～103%、95%～105%，RSD分別為2.48%、1.87%、2.24%。

2.8 考察線性關(guān)系

精密量取蕓香苷對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于具塞試管中，補(bǔ)充溶液至 10 mL，加入顯色劑靜置后，用50%乙醇水溶液定容至 25 mL，再靜置20 min，以50%乙醇水溶液為空白參比。在507 nm處測定各濃度對照品吸光度。取原花青素對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于10 mL具塞試管中，加入顯色劑，用甲醇定容至10 mL，遮光反應(yīng)20 min，以50%乙醇水溶液為空白參比，在497 nm處測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品吸光度。木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷進(jìn)樣量分別為2、5、10、15、20、25、30、35 μL，以甲醇為空白參比。因此，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和回歸方程分別為

Y1=14.196 0X1+0.012 6，r1=0.999 2;

Y2=10.668 0X2-0.010 1，r2=0.998 7;

Y3=4.0×100.6X3+506.2，r3=0.999 8。

其中，X1、X2、X3分別為蕓香苷、花青素、木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的質(zhì)量濃度;Y1、Y2為吸光度;Y3為峰面積。

3 結(jié)果與分析

3.1 柳屬生長性狀指標(biāo)測定結(jié)果

在柳屬種質(zhì)資源調(diào)查過程中，用卷尺和胸徑尺測量胸徑（地面上1.3 m處）;用卷尺測量冠幅的東西、南北2個方向直徑，取2個方向的平均值;用測高測距儀測量樹高。具體測量的柳屬植物樹高、胸徑、冠幅和分枝數(shù)的生長性狀指標(biāo)見表2，用于后續(xù)柳屬資源評價細(xì)節(jié)評分。

3.2 柳屬植物資源評價體系層次模型的判斷矩陣和權(quán)重

按照層次分析法對層次隸屬關(guān)系及指標(biāo)關(guān)聯(lián)性要求，建立柳屬資源綜合評價模型[17-20]。模型分為3層，第1層為目標(biāo)層（A），第2層為準(zhǔn)則層（B），

第3層為因子層（C）。采用德爾菲法進(jìn)行指標(biāo)權(quán)重的確定。給20位專家發(fā)函，內(nèi)容包括評價權(quán)重調(diào)查表和具體指標(biāo)性狀評分表，專家對7項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行賦分，采用4分制進(jìn)行打分，打分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

收回專家問卷并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。將數(shù)據(jù)輸入Yaahp 6.0，進(jìn)行兩兩因素相對重要性比對，采用四舍五入取整法構(gòu)建判斷矩陣，公式如下。

Wi=1n∑nj=1aij∑nk=1akj，i=1，2，…，n。

式中：Wi為第i項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重;aij為i指標(biāo)比j指標(biāo)的重要性等級;akj為k指標(biāo)比j指標(biāo)的重要性等級;n為指標(biāo)總數(shù)。

最終確定各準(zhǔn)則層、因子層的權(quán)重值大小。其中生長指標(biāo)和藥用指標(biāo)準(zhǔn)則層中，藥用性狀占主要部分，其權(quán)重為0.666 7，生長性狀次之，為0.333 3。綜合柳屬植物資源評價體系指標(biāo)權(quán)重分配情況，建立了柳屬植物資源評價體系，見表4。

3.3 總黃酮、原花青素、木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量

分別利用紫外-可見分光光度計(jì)和高效液相色譜儀測試柳屬葉片中總黃酮含量、原花青素含量、木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（木樨草苷）的含量（表5）。由表5可知，杞柳總黃酮含量最高，為0.225 6 mg/g;筐柳較高，為0.152 2 mg/g;含量居中（0.08～0.15 mg/g）的依次是谷柳、卷邊柳、蒿柳、越桔柳、毛枝柳、烏柳，其余的含量較低（<0.80 mg/g），含量最低的為三蕊柳（0.038 5 mg/g）。由表5可知，原花青素含量較高（≥0.10 mg/g）的是筐柳（0.156 8 mg/g）;含量居中（0.06～0.10 mg/g）的依次是金絲垂柳、松江柳、朝鮮柳、杞柳、卷邊柳、毛枝柳、興安柳;其余的含量較低（<0.06 mg/g），含量最低的為垂柳（0.012 5 mg/g）。由表5可知，通過對26種柳屬植物葉片提取物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)柳樹中都含有木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，然而深山柳、粉枝柳、朝鮮柳、蒿柳、卷邊柳、興安柳和越桔柳等7種柳屬植物在14.7 min處沒有出峰（圖1），因此判斷這7種柳屬中不含有木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷成分。各種柳屬木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量較高的（>1.00 mg/g）有五蕊柳、筐柳、細(xì)葉沼柳;含量中等（0.40～1.00 mg/g）有烏柳、沼柳、杞柳、松江柳、龍江柳;其余柳樹含量較低（<0.40 mg/g）。

3.4 柳屬種質(zhì)資源綜合評價和排序及優(yōu)質(zhì)柳屬的篩選

Y=∑Wiyi。

式中：Y為綜合評價得分;Wi為第i項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重值;yi為第i項(xiàng)指標(biāo)得分。

按上式計(jì)算柳屬各種質(zhì)資源價值綜合得分。在各項(xiàng)評分的基礎(chǔ)上進(jìn)行計(jì)算，求得各自綜合評價值。由表6可知， 綜合評價得分排序結(jié)果從高到低分別為旱垂柳、五蕊柳、筐柳、金絲垂柳、旱柳、垂柳、龍爪柳、朝鮮柳、卷邊柳、谷柳、三蕊柳、細(xì)葉沼柳、杞柳、大黃柳、龍江柳、松江柳、圓頭柳、毛枝柳、烏柳、細(xì)柱柳、沼柳、粉枝柳、蒿柳、深山柳、興安柳、越桔柳。

4 結(jié)論與討論

本研究以26種柳屬柳樹為研究對象，采用層次分析法對柳屬種質(zhì)資源進(jìn)行評價，構(gòu)建了柳屬種質(zhì)資源評價模型，設(shè)立了2個準(zhǔn)則層指標(biāo)，包括生長指標(biāo)和藥用指標(biāo)。設(shè)計(jì)專家調(diào)查問卷，建立判斷矩陣并計(jì)算各因子層指標(biāo)的權(quán)重。結(jié)合柳屬葉片藥用化學(xué)成分含量的紫外-可見分光光度計(jì)和高效液相色譜儀的檢測結(jié)果，獲得對資源價值定性和定量的綜合判斷分?jǐn)?shù)。

首次以藥用化學(xué)成分含量作為柳屬資源評價的二級指標(biāo)，采用紫外-可見分光光度法和高效液相色譜法測試柳屬中總黃酮、原花青素和木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。26種柳屬柳樹中總黃酮含量較高的為杞柳、筐柳、谷柳等。原花青素含量較高的為筐柳、金絲垂柳、松江柳等。除了深山柳、粉枝柳、朝鮮柳等8種柳屬植物以外，其他均含有木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，含量較高的為五蕊柳、筐柳、細(xì)葉沼柳等。據(jù)此推斷，不同地域生長的同物種，木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量不同，如哈爾濱的筐柳（40.67 mg/mL）比伊春的筐柳（30.91 mg/mL）含量高，可能是因?yàn)樯L環(huán)境不同，木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的累積量不同，也與樹齡有關(guān)。

基于層次分析法，將柳屬資源進(jìn)行綜合評價及排序，從生長性狀和藥用價值方面對柳屬資源進(jìn)行了科學(xué)評價，篩選出旱垂柳、五蕊柳、金絲垂柳、筐柳、旱柳和垂柳6種具有良好利用價值的優(yōu)良種質(zhì)資源，可作為遺傳育種方面研究的優(yōu)勢種質(zhì)，同時也為柳屬藥用資源開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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