田曉明 顏立紅 蔣利媛 向光鋒 李高飛 吳嘉 *

(1.湖南省森林植物園，湖南 長沙 410116；2.中南大學計算機學院 湖南 長沙 410083)

半楓荷(SemiliquidambarcathayensisChang)屬蕈樹科(Altingiaceae)半楓荷屬(Semiliquidambar)，為中國特有種、國家二級保護植物[1-2]。半楓荷藥用歷史悠久，其根、枝、葉、樹皮和花蜜均可入藥，具有祛風除濕、舒筋活血等功效[3]，民間多用其治療風濕性關(guān)節(jié)炎、類風濕關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、產(chǎn)后風癱、半身不遂，也可用于治療跌打損傷、扭挫傷[4]。

半楓荷資源稀少，分布零散，主要分布于江西南部、廣西北部、貴州南部、廣東(海南島在內(nèi))、湖南南部等地的山區(qū)，是當?shù)馗魃贁?shù)民族群眾常用藥材[5]。因其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，所以一直未能得到很好的開發(fā)利用。楊武亮[6]和周光雄等[7]均證實半楓荷醇提取物具有一定的消炎止痛效果，并從乙酸乙酯萃取物中分離鑒定了齊墩果酸、3-羰基齊墩果酸、硬脂酸等9種化合物。盧海嘯等[8]從半楓荷根中分離得到11個化合物，主要為三萜類化合物和鞣花酸衍生物。陳國德等[9]采用高效液相色譜法對半楓荷葉片中鞣酸、β-谷甾醇和硬脂酸含量進行測定。但有關(guān)半楓荷鎮(zhèn)痛抗炎活性部位尚不清楚，因此本研究對半楓荷乙醇總提物及其石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水溶部位的抗炎鎮(zhèn)痛活性進行篩選，并應(yīng)用LC-MS/MS技術(shù)對活性部位化學成分進行鑒別分析，以期為該民間藥材的臨床應(yīng)用和綜合開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1試驗動物 SPF級昆明種小鼠，體重18～25 g，雌雄兼有，購于福貝斯(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010。

1.2藥品與試劑 半楓荷根莖，采自湖南省靖州縣，10 kg，除去泥土灰塵洗凈，烘干，粉碎，75%乙醇加熱回流提取3次濾過，合并濾液，減壓濃縮，即得半楓荷乙醇提取浸膏。將乙醇提取浸膏存儲于4 ℃冰箱中，藥理試驗前以1.5%吐溫80配成1000，800和400 mg·kg-1劑量備用。取部分乙醇提取浸膏混懸于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5 次，合并各個萃取液，萃取后的水層及各溶劑萃取液減壓濃縮，得到石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位，正丁醇萃取部位，水溶部位。將所得的各相萃取物存儲于4 ℃冰箱中，藥理實驗前以1.5%吐溫80配成相應(yīng)濃度。阿司匹林(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；醋酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；二甲苯(分析純，杭州眾化科技有限公司)；吐溫80(上海信裕生物科技有限公司)；伊文思藍(Aiaddin公司)。

1.3方法

1.3.1對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 90只小鼠，雌雄各半，隨機分為9組(n=10)，空白組(1.5%，吐溫80，生理鹽水10 mL·kg-1)，陽性對照組(阿司匹林，100 mg·kg-1)，各個給藥組動物灌胃給藥1 h后，于每只動物的右耳里外兩面涂布40 μL二甲苯，該動物的左耳作為自身對照。4 h之后，脫臼處死動物，迅速剪下動物對稱的雙耳，用打孔器(直徑9 mm)分別在左右相同部位取下圓耳片，稱質(zhì)量，記錄質(zhì)量，同一只動物左右耳的重量差即為腫脹度。耳腫脹抑制率=(空白組腫脹度-藥物組腫脹度)/空白組腫脹度×100%。

1.3.2對醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性的影響 分組及給藥方法同1.3.1。各組于給藥 1 h 后，尾靜脈注射0.5% 伊文斯蘭(0.01 mL·g-1)，同時腹腔注射0.8% 醋酸0.2 mL·只-1，2 h后處死小鼠，腹腔注射 6 mL 生理鹽水，抽取腹腔液于4 ℃放置 6 h，取其上清液，用紫外可見分光光度計(590 nm)測定吸光度(A)值，計算抑制率。抑制率=(空白組A值-給藥組A值)/空白組A值×100%。

1.3.3對醋酸致小鼠扭體的影響 分組及給藥方法同1.3.1。各組于給藥1 h后腹腔注射體積分數(shù)0.8%的醋酸0.2 mL·只-1，觀察記錄注射醋酸后5～20 min內(nèi)小鼠產(chǎn)生扭體反應(yīng)(扭體反應(yīng)：小鼠腹部內(nèi)凹，后肢伸展，臀部抬起)的次數(shù)。計算藥物對疼痛反應(yīng)的抑制率。鎮(zhèn)痛率=(空白組扭體平均數(shù)-藥物組扭體平均數(shù))/空白組扭體平均數(shù)×100%。

1.3.4對熱板致小鼠疼痛的影響 分組及給藥方法同1.3.1。將雌性小鼠置于恒溫熱板上(55±0.5 ℃)，以小鼠舔后足潛伏期為痛閾值指標。試驗前篩選痛閾值為15～25 s的小鼠為合格鼠，為避免損傷小鼠足底組織，最長反應(yīng)時間為60 s。于給藥15、30、60 min測定小鼠痛閾值。鎮(zhèn)痛率=(空白組痛閾值-給藥后痛閾值)/空白組痛閾值×100%。

1.4活性部位成分LC-MS/MS初步分析

1.4.1色譜條件 采用LC-MS/MS(美國Thermo公司)分離活性部位中的化學成分，樣品過 0.22 μm有機微孔薄膜后上樣分析。液相條件為:Shim-pack GIST C18柱(2.1×75 mm，2 μm)(Shimadzu，東京，日本))；洗脫溶劑為0.1%甲酸(洗脫劑A)和甲醇(洗脫劑B)；流速0.2 mL·min-1；柱溫 25 ℃；進樣量 5 μL；洗脫梯度為：0 min，10%B；5 min，20%B；10 min，40%B；13 min，80%B；17 min，5%B。

1.4.2質(zhì)譜條件 采用正、負離子2種模式掃描測定，電噴霧ESI離子源。質(zhì)譜條件為：離子范圍m/z 100～1500；碰撞氣為氦氣；輔助氣體和屏蔽氣體為氮氣；噴霧電壓-4.5 kV；離子源溫度550.0 ℃；輔助氣和噴霧氣壓50.0 psi；氣簾氣壓35.0 psi；裂解電壓-80 V。

2 結(jié)果

2.1半楓荷不同部位提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 由表1可知，與空白對照組相比，乙醇提取浸膏不同劑量組、乙酸乙酯部位組對小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用；而石油醚部位、正丁醇萃位、水溶部位對小鼠耳腫脹的抑制作用與空白對照組相比差異不顯著。

表1 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

2.2半楓荷不同提取部位對醋酸致小鼠毛細血管通透性的影響 表2表明，半楓荷乙醇提取浸膏各劑量組能抑制醋酸所致的小鼠腹腔通透性增高，且隨著劑量的增加，抑制作用顯著加強；不同萃取部位均能不同程度降低小鼠腹腔毛細血管通透性作用，其中乙酸乙酯部位活性較強，抑制率分別為41.37%。

表2 對醋酸致小鼠毛細血管通透性的影響

2.3半楓荷不同提取部位對醋酸致小鼠扭體的影響 從表3中可以發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，乙醇提取浸膏中劑量組和高劑量組、石油醚部位組、乙酸乙酯部位組、水溶部位組均能顯著延長小鼠扭體潛伏期，但石油醚部位組、乙酸乙酯部位組和水溶部位組組間差異不顯著；半楓荷乙醇提取浸膏低劑量組和正丁醇部位組對于減少小鼠20 min 扭體次數(shù)作用均不明顯，與空白對照組差異不顯著。

表3 對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

2.4半楓荷各部位對熱板致小鼠疼痛作用的影響 從表4中可見，與空白對照組相比，乙醇提取浸膏中劑量組和高劑量組以及乙酸乙酯部位組均能提高給藥15 min時熱板致小鼠痛閾值，其余各組空白對照組相比差異不顯著；各提取部位組別均能提高給藥30 min時熱板致小鼠痛閾值，且組間差異也具有統(tǒng)計學意義；乙醇提取浸膏低劑量組和中劑量組、石油醚部位組和正丁醇部位組對提高給藥60 min時痛閾值不顯著，而乙醇提取浸膏高劑量組、乙酸乙酯部位組和水溶部位組均能顯著延長給藥60 min熱板法所致小鼠的痛閾值。總體來說，乙醇提取浸膏高劑量組和乙酸乙酯部位組在整個60 min內(nèi)均表現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)痛作用，且在同等劑量下(800 mg·kg-1)，乙酸乙酯部位組鎮(zhèn)痛作用優(yōu)于乙醇提取浸膏。

表4 對熱刺激致小鼠疼痛反應(yīng)時間的影響

2.5半楓荷乙醇提取物乙酸乙酯部位化學成分分析 對半楓荷乙醇提取物乙酸乙酯部位LC-MS/MS分析的結(jié)果如表5和表6所示。各色譜峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖經(jīng)人工解析及中藥化學數(shù)據(jù)庫(TCM)、未知物鑒定的新型數(shù)據(jù)庫(mzCloud)和化學結(jié)構(gòu)與文獻數(shù)據(jù)庫(ChemSpider)譜庫檢索定性，快速鑒別分析出44種化合物。半楓荷乙醇提取物乙酸乙酯部位有黃酮類成分7個，三萜類成分8個，環(huán)烯謎萜類成分2個，單萜類成分4個，酚類成分8個，其余為：氨基酸、苯丙素類、木脂素類、碳水化合物、香豆素類、異黃酮類、有機酸類成分共計15個。

表5 半楓荷乙醇提取物乙酸乙酯部位化學成分的LC-MS/MS鑒定結(jié)果(ESI+)

續(xù)表5 半楓荷乙醇提取物乙酸乙酯部位化學成分的LC-MS/MS鑒定結(jié)果(ESI+)

表6 半楓荷乙醇提取物乙酸乙酯部位化學成分的LC-MS/MS鑒定結(jié)果(ESI-)

3 討論

炎癥反應(yīng)是機體最基本的抗損傷反應(yīng)，也是感染等多種疾病最基本的病理過程[10]。早期炎癥反應(yīng)主要病理過程為：產(chǎn)生組織胺，羥色胺，緩激膚和前列腺素等炎癥介質(zhì)，促進血管舒張，增加血管通透性，進而導致毛細血管擴張和通透性亢進、滲出、水腫[11]。醋酸致小鼠毛細血管通透性增加試驗，以炎癥早期滲出為主作為依據(jù)，是藥物對于炎癥早期的抗炎作用測定常用模型之一[12]。二甲苯致小鼠耳腫脹法是急性炎性模型，利用二甲苯引小鼠機體內(nèi)一些炎癥介質(zhì)釋放[13]，繼而引起毛細血管通透性增加及炎性細胞的浸潤，造成耳部急性炎性水腫[14]?？寡啄Ｐ驮囼灲Y(jié)果表明半楓荷乙醇提取浸膏不同劑量組和乙酸乙酯部位組能明顯減輕二甲苯所致小鼠耳腫脹，明顯抑制醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加，顯示良好的抗炎作用。半楓荷可能是通過影響炎癥介質(zhì)產(chǎn)生抗炎作用的。

疼痛既是人體的一種反應(yīng)，也是多種疾病的主要癥狀，鎮(zhèn)痛藥物的研究一直是影響人類健康的熱點問題[15]。醋酸扭體法是用來篩選鎮(zhèn)痛藥物最常用的動物模型[16]。盡管醋酸扭體模型是非特異性痛覺模型[17]，但是目前的試驗結(jié)果仍然顯示半楓荷乙醇提取浸膏高劑量組和乙酸乙酯部位組灌胃給藥能明顯減少小鼠扭體次數(shù)，其作用可能是通過外周抗炎達到鎮(zhèn)痛效果。為了考察半楓荷各提取物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛作用，我們繼而采用熱板法(高位中樞鎮(zhèn)痛)來評價半楓荷的鎮(zhèn)痛作用。試驗結(jié)果顯示半楓荷乙醇提取浸膏高劑量組和乙酸乙酯部位組灌胃給藥能明顯延長熱板法所致小鼠的痛閾值，具有一定的中樞鎮(zhèn)痛活性。半楓荷乙醇提取浸膏和乙酸乙酯部位組在醋酸扭體法的鎮(zhèn)痛效果遠遠不如熱板法中的鎮(zhèn)痛效果，說明其鎮(zhèn)痛作用可能主要為中樞鎮(zhèn)痛。

乙酸乙酯部位組800 mg·kg-1劑量時，在二甲苯致小鼠耳腫脹、醋酸致小鼠毛細血管通透性影響、醋酸致小鼠扭體和熱板致小鼠疼痛試驗中與乙醇提取浸膏800 mg·kg-1劑量組和其他萃取組相比表現(xiàn)出更強的抗炎鎮(zhèn)痛作用，因而對乙酸乙酯部位組化學成分采用LC-MS/MS技術(shù)進行了快速的鑒別分析。共鑒定出44種化合物，主要為黃酮類、三萜類、環(huán)烯謎萜類、單萜類、酚類、氨基酸、苯丙素類、木脂素類、碳水化合物、香豆素類、異黃酮類、有機酸等物質(zhì)。本研究為今后半楓荷有效成分單體分離鑒定和開發(fā)利用提供了一定的科學依據(jù)。