黃仕其 郭琳 李玉澤 樊浩 黃文麗 鄧翀 王薇,3 宋小妹,3*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 71200；3.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712046)

捆仙繩為黃楊科板凳果屬植物頂花板凳果(PachysandraterminalisSieb.et Zucc.)的干燥全草[1-8]，全國各地均有分布，其主要產(chǎn)地集中于陜西，湖北，云南等地區(qū)，又名頂花板凳果、轉(zhuǎn)筋草、捆仙七。捆仙繩作為陜西秦巴山一帶特色藥材，為“陜西七藥”之一[9],具有祛風(fēng)止咳、舒筋活絡(luò)、調(diào)經(jīng)止帶等功效，主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性支氣管炎、婦科白帶等病癥[10-15]，現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)捆仙繩中主要含有甾體類生物堿成分[16-21]，然而對(duì)于捆仙繩總生物堿的含量測(cè)定和提取工藝則未發(fā)現(xiàn)報(bào)道。目前用于總生物堿總成分含量測(cè)定的方法主要包括化學(xué)分析法和分光光度法等，其中最為常用的是分光光度法結(jié)合酸性染料比色法[22-23]。響應(yīng)面法對(duì)于藥材中總生物堿提取工藝的研究方法成熟可靠，是一種解決提取過程中多因素多變量交叉問題的科學(xué)方法[24-26]，能夠通過科學(xué)合理的計(jì)算機(jī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法通過回歸方程和擬合系數(shù)給出最佳的提取工藝參數(shù)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用酸性染料比色法測(cè)定捆仙繩中總生物堿含量，采用響應(yīng)面法優(yōu)化總生物堿提取工藝，以此實(shí)驗(yàn)為后續(xù)研究捆仙繩藥材提供文獻(xiàn)參考價(jià)值。

1 儀器與試藥

1.1儀器 AL204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為0.1 mg)；BT25S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，精度為0.01 mg)；UV-2550型紫外分光光度儀(日本島津公司)；GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；回流冷凝管、電熱套、漏斗、分液漏斗、玻璃棒、250 mL圓底燒瓶、25 mL容量瓶、10 mL容量瓶、500 mL容量瓶、移液管、蒸發(fā)皿。

1.2試藥 捆仙繩藥材收集于陜西太白，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王薇教授鑒定為黃楊科板凳果屬植物頂花板凳果(PachysandraterminalisSieb.et Zucc.)的干燥帶根全草。spiropachysine B對(duì)照品(分離自制，純度≥98%)，試劑：氫氧化鈉、溴甲酚綠、鄰苯二甲酸氫鉀，實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水，乙醇等其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1溶液的制備

2.1.1對(duì)照品溶液制備 精密稱取spiropachysine B 5 mg，加三氯甲烷溶解并定容至10 mL容量瓶中，即得濃度為0.5 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2供試品溶液制備 按照單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的方法提取，將干燥的捆仙繩藥材粉碎，過四號(hào)篩，稱取10 g，置于250 mL規(guī)格圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入乙醇回流提取，過濾，溶液在水浴鍋蒸干，三氯甲烷溶解定容至25 mL容量瓶，加三氯甲烷至刻度，搖勻，作為供試品溶液，備用。

2.1.3溴甲酚綠緩沖液的制備 首先精密稱取溴甲酚綠250 mg，加入0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液25 mL使溶解；再精密稱取鄰苯二甲酸氫鉀5.10 g放人100 mL的燒杯中，加入約40 mL的蒸餾水并用玻璃棒攪拌使其充分溶解。然后將兩種溶液混合，移入500 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，調(diào)pH至5，備用。

2.2捆仙繩總生物堿測(cè)定方法的建立

2.2.1最大吸收波長(zhǎng)的確定 精密吸取樣品溶液和對(duì)照品溶液各1 mL分別置于已放入10 mL三氯甲烷的分液漏斗中，然后分別各加入3 mL溴甲酚綠緩沖液，振搖1 min，靜置待三氯甲烷液澄清后取三氯甲烷層，在200～800 nm波長(zhǎng)范圍掃描，結(jié)果在410 nm處有最大吸收。

2.2.2溴甲酚綠用量的選擇 顯色劑用量選擇1，2，3，4，5 mL進(jìn)行顯色測(cè)定，結(jié)果吸光度隨著用量的增大而先增大后減小，3 mL時(shí)吸光度達(dá)到最大，所以顯色劑選擇3 mL時(shí)最佳。

2.2.3三氯甲烷萃取用量的選擇 三氯甲烷、顯色劑、生物堿三者之間在分液漏斗進(jìn)行萃取時(shí)的比例對(duì)吸光度有一定影響，對(duì)三氯甲烷5，10，15，20 mL時(shí)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在10 mL時(shí)吸光度最大，所以選擇三氯甲烷萃取時(shí)選擇10 mL最佳。

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對(duì)照品溶液0.3,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6 mL分別置于5 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，各取1 mL按“2.2.1測(cè)定方法”項(xiàng)下測(cè)定。以吸收度(A)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(c)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程：Y=44.014X+0.0679，R2=0.9995結(jié)果表明捆仙繩對(duì)照品濃度在0.003～0.016 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2.5精密度試驗(yàn) 精密吸取樣品溶液1 mL，按優(yōu)化后的三氯甲烷10 mL和溴甲酚綠3 mL用量，在“2.2.1測(cè)定方法”項(xiàng)下測(cè)定，取三氯甲烷層溶液于410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，RSD=0.55%，表明儀器精密度良好。

2.2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批陜西產(chǎn)捆仙繩藥材，按照響應(yīng)面優(yōu)化得出最佳提取工藝，通過“2.1.2制備方法”項(xiàng)下制備，平行制備5份供試品溶液，按“2.2.1測(cè)定方法”項(xiàng)下測(cè)定，結(jié)果RSD=0.69%，表明重現(xiàn)性良好。

2.2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按響應(yīng)面工藝優(yōu)化后提取條件制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液1 mL，在“2.2.1測(cè)定方法”項(xiàng)下分別于30,60,90，120，150和180 min進(jìn)行測(cè)定，記錄吸光度值，1 h之內(nèi)測(cè)出的吸光度差異較小，結(jié)果RSD=7.40%，超出1 h后測(cè)吸光度顯著降低，表明供試品溶液在1 h內(nèi)基本穩(wěn)定，所以樣品要在1小時(shí)之內(nèi)測(cè)完。

2.3單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1回流提取時(shí)間的考察 稱取捆仙繩藥粉10 g，100%濃度乙醇，50 mL乙醇，按“2.1.2制備方法”制備和“2.2.1測(cè)定方法”同時(shí)在30，45，60，75和90 min條件下提取，測(cè)其吸光度。對(duì)捆仙繩總生物堿進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)分析。

2.3.2乙醇濃度的考察 稱取捆仙繩藥粉10 g，50 mL乙醇，提取時(shí)間60 min，按“2.1.2制備方法”制備和“2.2.1測(cè)定方法”同時(shí)在60%、70%、80%、90%、100%條件下提取，測(cè)其吸光度,對(duì)捆仙繩總生物堿進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)分析。

2.3.3液料比的考察 稱取捆仙繩藥粉10 g，提取時(shí)間60 min，80%乙醇，按“2.1.2制備方法”制備和“2.2.1測(cè)定方法”，在液料比5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1條件下提取，測(cè)其吸光度。對(duì)捆仙繩總生物堿進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)分析。

2.4響應(yīng)面設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及參考相關(guān)文獻(xiàn)，選取影響捆仙繩總生物堿提取率的3個(gè)主要影響因素：提取時(shí)間、乙醇濃度、液料比，以捆仙繩藥材總生物堿含量為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.06軟件設(shè)計(jì)的三因素三水平實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行研究。因素水平見表1，設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)

3 結(jié)果與分析

3.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度不斷增高，在60 min時(shí)吸光度達(dá)到最大，提取時(shí)間再延長(zhǎng)后，吸光度反而有所下降。80%乙醇吸光度最大，90%以后吸光度值下降且趨于平緩。在液料比15∶1和20∶1時(shí)吸光度值最大，且20∶1大于15∶1。

3.2捆仙繩總生物堿提取工藝結(jié)果 見表2。

3.3回歸方程的建立和方差分析 通過Design-Expert 8.06軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，得到二項(xiàng)多次回歸方程：P=0.39-0.014A+8.750E-003B+0.015C-7.500E-003AB-5.000E-003AC+0.000BC-0.049A2-0.069B2-0.041C2，R2=0.9533，方差分析結(jié)果見表3。由表中數(shù)據(jù)可以得到，回歸模型P=0.0007，表明該模型具有良好的顯著性。失擬項(xiàng)大于0.05，不顯著，表明回歸方程與實(shí)際情況的擬合程度良好，可以用于預(yù)測(cè)和篩選捆仙繩藥材的提取工藝。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9533，說明整體模型比較可靠。對(duì)回歸模型進(jìn)行顯著性分析，得到模型的一次項(xiàng)C顯著(P<0.05),A,B不顯著(P>0.05)，二次項(xiàng)B2極顯著(P<0.0001)，A2、C2顯著(P<0.01),各因素對(duì)捆仙繩總生物堿含量測(cè)定的影響大?。阂毫媳?提取時(shí)間>乙醇濃度。

表2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化捆仙繩總生物堿提取工藝

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

3.4多因素間交互作用分析

3.4.1乙醇濃度和提取時(shí)間的交互作用 圖1顯示在液料比為20∶1時(shí)乙醇濃度和回流提取時(shí)間對(duì)捆仙繩總生物堿含量測(cè)定的相互作用的3D模型。由圖1可見，固定A或B的任一值，含量曲線都會(huì)隨著其中單個(gè)因素的增大而先升高后降低，并且提取時(shí)間坡度較為平緩，而乙醇濃度坡度較陡，A與B交互作用較為顯著。

圖1 乙醇濃度和提取時(shí)間作用響應(yīng)面(左)和等高線圖(右)

3.4.2乙醇濃度和液料比的交互作用 圖2在回流提取時(shí)間為60 min時(shí)，乙醇濃度與液料比對(duì)捆仙繩總生物堿含量測(cè)定的交互作用的3D模型如圖2所示。固定B或C中任一值，含量曲線都會(huì)隨著其中單個(gè)因素的增大而先升高后降低，并且液料比坡度較為平緩，而乙醇濃度坡度較陡，B與C交互作用較為顯著。

圖2 乙醇濃度和液料比作用響應(yīng)面(左)和等高線圖(右)

3.4.3提取時(shí)間和液料比的交互作用 圖3表示當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)回流提取時(shí)間及液料比對(duì)捆仙繩總生物堿含量測(cè)定的交互作用的3D模型。由圖3可見，固定A或C中任一值，含量曲線都會(huì)隨著其中單個(gè)因素的增大而先升高后降低，但是A與C在各自范圍內(nèi)的曲面均較為平坦，因此，A與C交互作用不顯著。

圖3 提取時(shí)間和液料比作用響應(yīng)面(左)和等高線圖(右)

3.5最佳提取工藝條件確認(rèn) 通過回歸模型，依據(jù)響應(yīng)面分析法對(duì)捆仙繩總生物堿含量測(cè)定選擇maximize模式進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而得到捆仙繩總生物堿最優(yōu)的提取工藝參數(shù)為：液料比為20.72∶1(g·mL-1)、乙醇濃度為80.29%，回流提取時(shí)間為69.40 min。根據(jù)實(shí)際操作情況，設(shè)置液料比、乙醇濃度、回流提取時(shí)間依次為20∶1、80%、70 min。總生物堿含量預(yù)期值為0.363%。

3.6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 采用上述確定的工藝條件，每次稱取捆仙繩約10 g,進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，最佳工藝條件下捆仙繩總生物堿含量的平均值能達(dá)到0.35%(n=3，RSD=0.79%),由此可見該模型合適有效。

4 討論

萃取溶劑的選擇、酸性染料的選擇和其用量程度大小，以及pH值大小是影響測(cè)定結(jié)果靈敏度和準(zhǔn)確性的重要因素。它要求酸性染料與生物堿在一定的pH下定量結(jié)合，并且結(jié)合的生物堿-酸性染料離子對(duì)在有機(jī)相中有較大的溶解度，而酸性染料在有機(jī)溶劑中不溶或很少溶解，同時(shí)在特定波長(zhǎng)下有較強(qiáng)的吸收。對(duì)于生物堿而言，三氯甲烷是較理想而最為常用的溶劑。只有在適當(dāng)?shù)膒H值溶液中，酸性染料才能完全地與生物堿陽離子結(jié)合成能被有機(jī)溶劑萃取的離子對(duì)絡(luò)合物，緩沖液的pH過低或過高均會(huì)對(duì)離子對(duì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生很大的影響，甾體類生物堿一般使用鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉緩沖液，pH為4～5[23]，故在本文中未對(duì)pH值的大小進(jìn)行篩選，選取pH為5。